导　　师： 潘力

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南理工大学

摘　　要： 食品安全问题是全球人类共同面对的和亟待解决的难题之一,其中控制由微生物污染造成的食品安全问题,又是其中最重要的一项议题。ATP快速检测技术,能对食品的微生物ATP提取和检测,能够在几十分钟内,获取污染微生物的检测结果。荧光素酶则是ATP快速检测技术的核心组件,因此该酶的需求与日俱增。北美萤火虫荧光素酶,是商业化的荧光素酶,通常用作报告基因或活体生物荧光成像技术,也用于ATP快速检测。已有大肠杆菌生产该荧光素酶的相关研究,但是该系统不能将酶直接分泌到胞外,而且培养过程需要添加抗生素维持遗传特性,单位体积发酵液产量不高等。据此本研究旨在将常用的北美萤火虫荧光素酶,使用毕赤酵母这真核系统解决此类问题,以期为最终规模化制备荧光素酶提供理论和技术支持。首先,根据北美萤火虫（Photinus pyralis）的序列,设计引物从报告基因载体pGL2-control上克隆荧光素酶基因luc,构建诱导型表达载体pPIC9K-luc和pPICZαA-lucM,并且转化其宿主Pichia pastoris GS115获得高效表达荧光素酶的重组菌GS115/pPIC9K-luc和GS115/pPICZαA-lucM,胞外、胞内具有较高的荧光素酶活性。SDS-PAGE鉴定荧光素酶的分子量分别为70 kD和75 kD。利用超滤、阴离子交换层析和分子筛层析纯化无标签的荧光素酶（前者表达株）,获得68 mg/L产量的荧光素酶,回收率为35%（胞外）、33%（胞内）,最大酶比活可达7.00×108 RLU/mg;利用镍亲和层析柱和超滤纯化带组氨酸标签的荧光素酶（后者表达株）,获得88 mg/L产量的荧光素酶,回收率为55%（胞外）和53%（胞内）,最大比活达到7.12×109 RLU/mg。继而对纯化的带标签的荧光素酶进行去糖基化分析、基本酶学特性分析,发光体系优化和稳定性等进行了初步研究。发现该酶的糖基化程度为13.3%,酶对底物ATP和荧光素的结合常数Km分别为100μmol/L和17.5�

关 键 词： 荧光素酶 毕赤酵母 诱导表达 生物发光

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