导　　师： 苏磊

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 广州中医药大学

摘　　要： 目的:中暑是一种严重的热性疾病,主要表现为体温过高与中枢神经系统功能障碍,严重的中暑可导致多脏器功能衰竭,具有较高的死亡率与致残率。当前研究认为,下丘脑主动参与体温调节功能障碍,在重症中暑发生过程中具有关键作用,但目前具体病理生理机制尚未明确。本研究中通过建立重症中暑小鼠模型,利用组织病理学、二维荧光差异凝胶电泳分析、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱明确下丘脑的损伤并分析鉴定下丘脑差异表达的蛋白质,进一步通过嗜铬细胞瘤-12(PC12)神经元细胞系建立热打击神经元细胞模型研究海马钙结合蛋白对细胞凋亡的作用,以揭示重症中暑神经元细胞的病理过程。最后,通过在体、体外研究乌司他丁在热打击动物与细胞中的作用及具体可能作用机制,并进一步验证HPAC的作用,为重症中暑的临床治疗以及研究提供基础与新思路。方法:在体实验中利用仿真气候舱建立中暑小鼠模型,利用组织病理学检测不同中暑程度小鼠下丘脑损伤情况;通过荧光二维差异凝胶电泳分析下丘脑中14种差异表达的蛋白质,并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,并选择海马钙结合蛋白(HPAC)作为我们的研究对象,应用TUNEL、Western blot、免疫组化法检测了重症中暑小鼠下丘脑中HPAC的表达与细胞凋亡水平,明确其在重症中暑下丘脑神经元细胞凋亡中的作用。在体外实验中,利用大鼠PC12神经元细胞株建立热打击神经元凋亡检测体系,通过MTT检测热打击后细胞活力、流式细胞术及蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase-3的片段化及活性变化,并通过过表达HPAC质粒与HPAC靶向siRNA转染PC12细胞,研究HPAC在重症中暑小鼠与热打击PC12细胞中的作用。通过在体、离体给予乌司他丁预处理治疗,细胞上检测MTT细胞活力、流式细胞术、Caspase-3片段化及活性等,小鼠中暑模型上检测下丘脑组织病理损伤、TUNEL、免疫组化及Western blot等以研究乌司他丁在重症中暑小鼠与热打击PC12细胞中的作用及与HPAC的关系。成果:重症中暑小鼠模型与热打击PC12细胞模型均显示下丘脑神经元细胞损伤,表现为热打击后下丘脑组织损伤随着温度升高而加重与Caspase-3活性与片段化水平增加。此外,PC12细胞热打击后细胞活力下降、Caspase-3活性增加、流式细胞术凋亡阳性细胞比例升高,均提示热打击促使神经元细胞凋亡。通过二维荧光差异凝胶电泳与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析鉴定中暑小鼠下丘脑中14种差异表达的蛋白质,结果表明,这些蛋白质主要参与能量和物质代谢、细胞动力、细胞增殖和凋亡。通过免疫组化和蛋白质印迹,证实在中暑小鼠的下丘脑和热打击的PC12细胞中HPAC的表达下降。进一步予HPAC过表达质粒和siRNA-HPAC转染后热打击发现,HPAC在PC12细胞和下丘脑热损伤中起抗凋亡的作用。最后,体外和体内使用乌司他丁预处理可抑制热诱导的HPAC表达的下调,保护下丘脑神经元和PC12细胞免受热打击诱导的细胞凋亡,并可增加中暑动物的耐热性。结论:HPAC在中暑小鼠的下丘脑和热打击的PC12细胞中表达下调,并具有抗凋亡作用。使用乌司他丁干预HPAC表达的下调可减轻细胞凋亡,保护下丘脑神经元细胞,增加中暑动物的耐热性。总而言之,我们的研究揭示并证明了 HPAC在重症中暑小鼠下丘脑神经元损伤中具有抗凋亡的保护作用。更多还原

关 键 词： 热打击 [7603247]PC12 Hippocalcin [341429]凋亡 [3966675]乌司他丁

分 类 号： [R594.12]

领　　域： []