导　　师： 严寒静

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 广东药科大学

摘　　要： 唇形科刺蕊草属植物广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth为“十大广药”之一,作为传统的芳香化湿药,其挥发油由于具有调节胃肠道、抗炎、抗病原微生物等生物活性而被作为医药领域的重要原料。此外,还被广泛应用于食品、化妆品领域。广藿香油的组分多为倍半萜类化合物,数量超过24种,广藿香醇是其中的主要成分之一。研究广藿香中倍半萜类化合物生物合成机制,从而提高药材中广藿香油,尤其是广藿香醇的产量,对广藿香药用资源的开发和利用具有重要意义。广藿香醇合酶(Patchoulol synthase,PTS)是广藿香中合成广藿香醇的关键酶,能催化倍半萜的前体法呢基焦磷酸(Farnesyl diphosphate,FDP)生成广藿香醇等倍半萜类化合物。本课题采用一步法RT-PCR从海南儋州广藿香中获得PTS基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明广藿香PTS基因的cDNA全长为1659bp,为一个完整的开放阅读框(ORF),编码552个氨基酸,该蛋白分子量为64.1 kD,等电点为5.39,具有两个倍半萜合酶结构域,C末端结构域268个氨基酸残基可能涉及线性萜烯的环化,该结构域中含有DDxxD、RxR和RRx8W三个保守序列。用环形聚合酶延伸克隆(CPEC)法将得到的PTS基因构建到原核表达载体pET28a、pET32b和植物表达载体pRI101-AN上,得到pET28a-PTS、pET32b-PTS原核表达载体和pRI101-PTS(GBD)植物过表达载体。此外,克隆PTS基因上500 bp作为反义序列,同样构建到pRI101-AN载体上,得到反义RNA沉默载体pRI101-PTS(GR)。构建完成后的pET28a-PTS、pET32b-PTS表达载体在BL 21(DE 2)菌株中诱导表达,结果发现广藿香醇合酶在大肠杆菌中表达时有强烈的形成包涵体倾向,即使与能增强蛋白可溶性的硫氧还蛋白(TRX)融合,在较低的温度和IPTG浓度下(20℃和0.25 mM),仍然不能观察到可溶性表达。对pET32b-PTS菌株进行诱导条件优化,但可溶性蛋白依然不可见。在25℃,0.5 mM IPTG时,目的蛋白表达量达到最高。以该条件进行TRX-PTS的大量表达,并对包涵体进行复性,以含6 M盐酸胍的复性液溶解包涵体,依次用含3 M、2 M、1 M、0 M、0 M盐酸胍的复性液的顺序进行透析,最终转移至10 mM HEPES缓冲液中透析。SDS-PAGE检视结果表明复性成功且得到较纯的TRX-PTS融合蛋白。将过表达载体pRI101-PTS(GBD)和反义RNA沉默载体pRI101--PTS(GR)用冻融法转化LBA 4404根癌农杆菌。将预培养基中培养3天的广藿香叶盘作为外植体,分别用过表达和反义RNA沉默菌株进行侵染。经3~4天共培养后将叶盘转入筛选培养基中,共得到过表达组和反义RNA沉默组各250瓶左右,每瓶3~4个叶盘。筛选过程中,未转化的外植体逐渐褐化死亡,成功转化的叶盘逐渐在切口处长出愈伤,但由于广藿香对Kan较为敏感,所以较难分化出芽。在暂时解除Kan压力之后,抗性愈伤开始分化出芽。在芽长至1.5-2 cm时切下生根。共得到过表达组广藿香再生苗58棵,反义RNA沉默再生苗104棵。最终,由PCR鉴定得到转基因PTS过表达广藿香植株3棵,反义RNA沉默植株5棵。更多还原

关 键 词： 广藿香醇合酶 生物信息学 [6344375]过表达 [6620496]反义RNA

分 类 号： [S567.239]

领　　域： []