导　　师： 杜新

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 广州医科大学

摘　　要： 背景:伊马替尼（imatinib,IM）等酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）可以特异性抑制BCR-ABL1融合基因产物活性,从而抑制肿瘤细胞增殖。但20%0%患者服药后出现TKI耐药,主要原因之一是BCR-ABL1激酶结构域（kinase domain,KD）出现点突变。目前常用Sanger测序法（Sanger sequencing,SS）检测融合基因突变位点,但其敏感性较低,无法识别突变丰度低于15%0%的低水平突变,同时不能分析多个突变种群的克隆结构。二代测序技术（next-generation sequencing,NGS）通过增加测序通量,检测突变灵敏度可达1%以上,并且在多数情况下能揭示复杂的克隆纹理。目的:1.研究NGS技术能否准确检测慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）患者BCR-ABL1 KD低水平突变,建立检测BCR-ABL1融合基因突变高灵敏度的新方法;2.进一步揭示多突变种群的克隆结构,并讨论这种高敏感度的基因突变检测方法与临床相关性。材料与方法:收集我院22名经TKIs序贯治疗失去主要分子学反应（MMR:BCR-ABL1≤1%IS）的CML患者外周血样本40例/次进行分析。（1）取患者外周血2ml,Trizol法提取总RNA,逆转录成cDNA后采用PCR扩增BCR-ABL1KD,回收纯化PCR产物。（2）分别采用SS和NGS两种测序方法检测BCR-ABL1KD基因突变,比较两者的差异并分析突变基因的克隆演变及TKIs耐药的相关性。（3）采用TA克隆技术对特殊样本进行直接测序,验证克隆群体的复杂性（复合突变与多克隆突变）。实验数据均采用SPSS19统计软件进行数据分析处理,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.NGS共检测出12种与TKIs临床耐药相关突变,分别为:M244V、Y253H、E255A/K、E292V,V299L,T315I,F359C/I,F317L,H396R,C475Y;SS共检出8种耐药相关突变:E450A/K,F359C/I,T315I,V299L,Y253H,M244V。2.7例样本经SS检测阴性而NGS检测出10处点突变,丰度在1.20%3.18%,其中8个突变丰度已超出Sanger测序检测的最低阈值（15%0%

关 键 词： 激酶结构域 基因突变 酪氨酸激酶抑制剂 二代测序 测序

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