导　　师： 李爽

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南理工大学

摘　　要： 可持续发展观念越来越深入到社会各个领域中,寻求可再生能源来代替化石能源逐渐受到更多人的关注。半纤维素作为一种重要的可再生能源分布在地球上的各个角落里,但是传统的物理、化学方法降解半纤维素对环境不够友好。因此寻求一种生物的方法来温和的对半纤维素分解对于解决环境与能源问题都十分必要。β-甘露聚糖酶(β-mannanase,EC 3.2.1.78)属于半纤维素酶类,可以在β-1,4-D-甘露聚糖分子的主链内部随机切割β-1,4-D-甘露糖苷键,产生不同长度的低聚甘露糖。低聚甘露糖作为添加剂在动物饲料行业有广泛的应用,也是膳食纤维的重要成分,此外在造纸、纺织业、医学、药学、食品及石油开采等领域也具有重要的应用价值。课题组研究发现,以槐豆胶作为唯一碳源发酵培养,嗜热厌氧杆菌Thermoanerobacterium aotearoense P8G3#4的发酵液上清可以检测到β-甘露聚糖酶活性。在此基础上,本研究克隆鉴定了该菌株的β-甘露聚糖酶编码基因。序列分析表明,该基因的开放阅读框长1548 bp,编码515个氨基酸,其中前25个氨基酸为分泌信号肽序列。同源比对结果显示,它属于糖苷水解酶家族26(Glycoside Hydrolase Family 26,GH26)。将切除信号肽的甘露聚糖酶(Man25)克隆至pET30a,成功以E.coli BL21(DE3)为宿主得到表达。经镍柱亲和层析和脱盐两步得到β-甘露聚糖酶纯品(纯度>95%)。Man25的最适催化条件为55 C,pH 5.5,且表现出较好的温度稳定性:在50 C保温120 min,酶活约保留80%。底物特异性研究显示,该酶对槐豆胶表现出较高的水解活性,V达2498.91 U/mg,K为1.98 mg/m L。金属离子对酶学性质影响研究发现,反应体系中添加5 mM Ca可明显提高甘露聚糖酶的活性和热稳定性,使得酶的活性提高15%,半数热失活(Tm)上升到了57 C。EDTA添加导致的酶活损失,可通过额外添加Ca、Fe、Mn和Mg等离子恢复。为了便于后续针对�

关 键 词： 甘露聚糖酶 嗜热厌氧杆菌 热稳定性 钙离子 平板筛选

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