导　　师： 邱平明

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 南方医科大学

摘　　要： 目的:　　建立METH中毒的体内外模型，初步探讨α-Syn在泛素蛋白酶体途径中降解障碍而引起神经元损伤中的作用。利用分子生物学技术、细胞生物学技术、神经生物学技术等，通过α-Syn及其丝氨酸129位点磷酸化水平pS129α-Syn、PLK2、CD3δ、Caspase-3、PARP及Parkin等指标的检测，从而研究METH诱导的氧化应激对神经元的损伤作用。再通过SH-SY5Y细胞Parkin过表达慢病毒转染实验及C57小鼠纹状体立体定位技术进一步明确Parkin在α-Syn异常表达中所起的作用，以及METH、Parkin和α-Syn这三者之间的联系，为METH在神经系统损伤机制研究中提供新的靶点。　　方法:　　1.蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞　　用含10％新生胎牛血清(FBS)的DMEM-F12培养基接种SH-SY5Y细胞至6cm培养皿或6孔板中，于37℃和5％CO2条件的温箱中培养，待6孔板中细胞长至70％～80％汇合时，分别用含0mmol/L、DMSO、50nmol/L、75nmol/L、100nmol/L、150nmol/L MG132的2％血清培养基培养24小时，收集细胞并提取蛋白进行检测:Western Blot法检测α-Syn;免疫共沉淀(CO-IP)方法检测α-Syn的泛素化情况。　　2.METH中毒细胞模型的建立　　按照上述方法培养细胞，待6孔板中细胞长至70％～80％汇合时，分别用含0mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L METH的2％血清培养基培养24小时或用2.0mmol/L METH的2％血清培养基分别培养0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时。收集细胞或提取细胞总蛋白进行以下各项实验:　　(1)Western Blot法检测α-Syn及其磷酸化水平pS129α-Syn、PLK2、蛋白酶体活性标志分子CD3δ、凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP及Parkin等指标。　　(2)免疫荧光法检测α-Syn及Parkin表达变化，并采用共聚焦显微镜观察细胞内α-Syn及Parkin表达变化。　　(3)免疫共沉淀(CO-IP)方法检测α-Syn及Parkin的相互作用关系。　　3.METH亚�

关 键 词： 甲基苯丙胺 神经毒性 突触核蛋白 蛋白表达 蛋白

领　　域： []