导　　师： 余榕捷

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 暨南大学

摘　　要： 目的:B类GPCR（G protein coupled receptor,GPCR）PAC1-R是神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽（Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP）的偏好受体,其介导有效的神经保护活性。PAC1-R具有一个相对较大并且结构复杂的N-端胞外结构域（PAC1-EC1）,负责识别和结合配体。我们已有的研究显示具有显著体内外神经保护作用的强力霉素（Doxycycline,DOX）和米诺环素（Minocycline,MINO）可以作为PAC1-R的正向别构调节剂（Positive allosteric modulator,PAM）通过结合PAC1-EC1促进PAC1-R的正位激活（Yu R*,et al.Neuropharmacology.2015;103:1-15.）。基于以上研究基础,本研究拟通过计算机分子对接、微量热电泳（Microscale Thermophoresis,MST）、定点突变和cAMP检测等技术,分析和比较DOX/MINO及其衍生物,包括DOX不同修饰物、四环素（Tetracycline,TET）和替加环素（Tigecycline,TIGE）对PAC1-R的别构调节作用,试图详尽PAC1-R的N-端胞外结构域中正向别构调节剂结合位点的细节,为后续靶向PAC1-R的新型别构调节剂的筛选奠定基础。方法:利用Discovery Studio 2.5 Libdock获得DOX/MINO/TET/TIGE与PAC1-EC1的分子对接3D模型,并分析比较它们结合位点的信息;随后从分子水平利用MST分析技术测定DOX/MINO及其衍生物与PAC1-EC1结合的亲和力（平衡解离常数KD,解离百分比DP）;利用已建立的人为高表达PAC1-R偶联增强型绿色荧光蛋白（enhanced Green Fluorescence Protein,eGFP）的PAC1-CHO细胞系结合cAMP检测和MTT检测,从细胞水平检测DOX/MINO及其衍生物对PAC1-R正位激动剂PACAP（1-13）正位激活的别构调节作用;运用蛋白别构位点预测软件AlloSite对PAC1-R的N端胞外域进行别构调节位点预测;通过分析对比预测结果和分子对接结果中作用残基出现的频率,筛选出对PAM主要贡献的四个关键基序;最后通过定点突变获得与关键基序相应的PAC1-EC1四个突变体的重组蛋白,并结合MST检测

关 键 词： 垂体腺苷酸环化酶激活多肽 垂体腺苷酸环化酶激活肽 型受体 强力霉素 米诺环素 端胞外域 别构调节 突变体 正向别构调节剂

领　　域： []