导　　师： 胡琼波;秦长生

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 绿僵菌素（destruxin）是金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae产生的一种环缩肽类化合物，绿僵菌素A（DA）是最常见的一种绿僵菌素同系物，具有杀虫活性，能抑制昆虫先天性免疫作用，但其分子水平的作用机制仍不清楚。本课题组在前期研究中，利用DA处理家蚕Bombyx mori Bm12细胞后，提取总蛋白质，再用蛋白酶降解，再通过电泳分离了特异性条带，经质谱鉴定该条带中包5种热休克蛋白（heats hock proteins，HSP）（BmHSP70，BmHSP75，BmHSP90，BmHSCP，BmHSP97），疑似它们与DA存在互作关系。因此，本研究拟构建这5种家蚕热休克蛋白的原核表达系统，通过镍亲和层析分离纯化目标蛋白，然后采用生物膜干涉（Bio-Layer Interferometry，BLI）技术分析这些热休克蛋白与DA的亲和力，最后通过荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）技术对DA处理家蚕Bm12细胞后上述热休克蛋白基因表达量进行定量分析，验证其是否为DA的结合蛋白。本文研究结果将为阐明D A作用的分子机理提供参考。主要研究结果如下：　　（1）家蚕热休克蛋白原核表达　　从家蚕Bm12细胞中提取总RNA，通过RT-PCR反转录和PCR扩增，分别克隆出BmHSP75，BmHSP90，BmHSCP，BmHSP97与 BmHSP70的全长编码序列，将扩增产物与pEASY-T载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经过Kan-IPTG-Xgal平板筛选及PCR鉴定，初步获得了含HSP基因的阳性克隆。采用双酶切法将HSP片段连接到原核表达载体pET-30a上，并转化感受态细胞。利用卡那霉素抗性筛选出阳性菌落，通过鉴定引物T7/T7ter鉴定出阳性克隆，并进行DNA测序。结果表明，目的基因测序结果正确，筛选得到的阳性克隆菌液检测均连接成功，重组子测序结果与目的序列能够完全匹配，各重组子构建成功。　　（2）镍亲和层析纯化目标蛋白　　重组子原核表达菌株BL21（DE3），经IP

关 键 词： 家蚕 热休克蛋白 绿僵菌素 原核表达 质谱鉴定

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