导　　师： 林宏生; 郭国庆

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 暨南大学

摘　　要： 目的:探讨spastin能否进行SUMO(Small ubiquitin-like modifiers)化修饰及SUMO化修饰如何调控微管动态性从而影响神经元生长发育。方法:首先,用pull down、Co-IP、免疫细胞荧光染色及BIFC的方法检测spastin在体内外是否与SUMO结合。通过软件预测spastin潜在的SUMO化位点,并通过免疫荧光化学和分子实验鉴定spastin的SUMO化修饰位点。然后,根据突变位点构建的突变体质粒转染神经元,细胞免疫荧光化学观察神经元突起生长的变化。将spastin与SUMO1或SENP1共转COS1细胞,确定不同spastin SUMO化修饰状态对微管切割的影响。用免疫荧光染色的方法分析spastin K427R如何影响微管的动态性;接下来过表达spastin K427R观察spastin K427R促进或抑制微管的修饰,并确定其对海马神经元生长的影响;最后,通过免疫细胞化学染色观察spastin对不同修饰状态下微管切割活性的影响,确定spastin对不同修饰状态的海马神经元突起生长的影响。结果:(1)Pull down及Co-IP实验显示,SUMO蛋白可以成功的层析出spastin蛋白;免疫化学染色实验显示spastin与SUMO存在共定位;BIFC实验显示,转染SUMO1-N YFP+spastin-C YFP转染组观察到了清晰的黄绿色荧光,荧光分布呈现微管的形状;(2)预测spastin存在3个潜在的SUMO化位点,发现spastin K427 AAA失去了切割微管的活性;进一步发现spastin K427A和spastin K427R失去了切割微管的活性;Co-IP实验结果表明Spastin K42R不与SUMO1结合;(3)Spastin K305AAA和K530AAA可以促进突起分支;而突变K427之后的K427AAA和panAAA都不能促进突起发育,甚至出现了抑制突起生长的情况;(4)Spastin与SUMO共转COS1细胞,细胞微管荧光强度较对照组明显减弱。Spastin与SENP1共转COS1细胞,细胞微管荧光强度较对照组增强;(5)GST pull down显示spastin K427R蛋白可以成功的层析出tubulin微管蛋白;免疫化学染色显示spastin K427R与不同修饰状态下的tubulin存在共定位;(6)Spastin K427R�

关 键 词： 类泛素化 海马神经元 微管的修饰 微管动力

领　　域： []