导　　师： 李湘平

学科专业： J0213

授予学位： 博士

作　　者： (）;

机构地区： 南方医科大学

摘　　要： 背景与目的:鼻咽癌是我国南方及东南亚地区一种常见的恶性肿瘤,临床以分化低、高转移为主要特征,临床上75%～90%的鼻咽癌病人初诊时已是局部晚期并发生颈部淋巴结转移。尽管以调强放疗技术为主的放化疗综合治疗使鼻咽癌的局控率有明显提高,但目前临床上仍无法对鼻咽癌转移进行早期预测和有效干预,其远处转移率和总体生存率并没有显著改观,一旦复发转移则预后较差,平均中位生存期只有7.3～10个月,远处转移仍是病人死亡的主要原因。因此,全面解析鼻咽癌转移的分子机制,积极寻求切实有效且安全可靠的治疗新途径,是有效控制鼻咽癌转移从而提高患者生存率的关键。外泌体被证实能介导肿瘤细胞与周围组分进行信号传导和蛋白质、核酸等内容物垂直传递来诱导转移前微环境形成,促进转移的发生。因此,外泌体在肿瘤转移中起到了非常重要的作用,可以是预测和预防肿瘤转移的标记物和新治疗靶点。肿瘤血管生成和血管通透性增加亦是转移前微环境的特点之一,是促进转移的必要条件,亦被认为是治疗肿瘤和防止肿瘤复发转移的靶点。目前,已有肿瘤血管靶向药物用于临床并取得了鼓舞人心的临床疗效。但肿瘤的血管生成是个极其复杂的过程,且大多数肿瘤血管靶向治疗药物均针对非特异性地阻断VEGF信号通路,导致产生血压升高等副作用和药物抵抗性。因此,还需要积极地去寻找全新的特异性更高的肿瘤血管治疗靶点,增强肿瘤血管靶向治疗的效果。研究显示microRNA在肿瘤血管生成机制中扮演着重要的角色,影响血管生成的miRNA被命名为angiomiR。angiomiR的发现为肿瘤血管靶向治疗开辟了新的领域,与既往单一靶点的抗血管生成药物相比,如若能通过纠正angiomiR的表达异常达到抑制肿瘤血管生成的目的,则有可能避免药物的副作用及药物的抵抗性。肿瘤细胞被证实分泌microRNA由外泌体介导进入血管内皮细胞影响肿瘤的血管生成。在本课题组前期的研究中,miR-9被证实参与鼻咽癌转移,但其表达异常是否能影响肿瘤血管生成继而影响转移,以及鼻咽癌细胞是否能分泌miR-9由外泌体运载进入血管内皮细胞从而影响血管生成等一系列问题都不得而知。因此,为了明确miR-9表达失调对鼻咽癌血管生成的影响,证实鼻咽癌细胞分泌的miR-9以外泌体介导进入内皮细胞发挥功能,阐明分泌型miR-9对血管内皮细胞产生影响的分子机制和信号通路,我们进行了相应的研究。材料和方法:1、免疫组化和原位杂交:50例鼻咽癌组织石蜡标本切片行CD31免疫组化与miR-9原位杂交;100例鼻咽癌组织和80例鼻咽炎组织石蜡标本切片行MDK免疫组化。2、慢病毒包装感染、exosome抽提及鉴定、示踪实验:慢病毒包装感染构建稳定过表达miR-9、空载对照5-8F和CNE1细胞株;细胞上清液收集,差速离心法提取外泌体/Exoquick试剂提取外泌体;nanosight、western blot(CD63、TSG101)、电镜验证外泌体;RNA提取,RT-qPCR检测miR-9基因表达;CY3标记miR-9,PKH67标记外泌体,激光共聚焦显微镜示踪实验。3、体内外功能试验:CCK8、侵袭实验、成管实验、基质胶栓实验。4、靶基因预测及验证:Targetscan、Pictar、miRBase生物信息学软件预测靶基因,RT-qPCR对候选靶基因进行筛选;针对筛选出来的靶基因MDK使用双荧光素酶报告基因实验及western blot进行验证;磷酸化抗体芯片及western blot检测信号通路PI3K/AKT和MAPK磷酸化蛋白水平5、统计学分析:应用统计学软件SPSS20.0进行统计学分析。计量资料两组间差异比较采用两独立样本t检验(independent-samples ttest)。采用Spearman法对免疫组化和原位杂交半定量结果进行相关性分析。CCK8增殖实验采用析因方差分析(factorial design ANOVA)。多组等级资料的比较采用Kruskal-Wallis秩和检验,分类数据利用χ2检验进行比较。Kaplan-Meier法绘制生存曲线。生存期的多因素分析采用Cox回归模型。结果1、鼻咽癌组织标本中,Ⅲ～Ⅳ期miR-9表达显著降低(Z=-3.635,P<0.001),MVD 显著升高(t=-3.507,P=0.001),miR-9 表达与 MVD 表达呈负相关(r=-0.3075,P=0.0298)。2、稳定过表达miR-9鼻咽癌细胞株的建立及exosome的抽提和鉴定:稳定过表达miR-9的鼻咽癌细胞株5-8F Lv-miR-9中,miR-9表达量为对照组细胞的61.487倍(P=0.0016);CNE1 Lv-miR-9细胞株中miR-9的表达为对照组细胞的48.05倍(P=0.0048)。稳定过表达miR-9的鼻咽癌细胞株均可以分泌外泌体,与对照组相比,其外泌体的数量和形态相似,外泌体中miR-9的表达与细胞内miR-9表达水平一致,过表达miR-9组5-8F Lv-miR-9外泌体中miR-9表达为对照组外泌体的36.56倍(P=0.0016);CNE1 Lv-miR-9外泌体中miR-9表达为对照组外泌体的24.77倍(P=0.0015)。激光共聚焦结果显示鼻咽癌细胞分泌红色荧光CY3标记的miR-9由绿色荧光标记的PKH67-外泌体运载进入血管内皮细胞3、体内外功能实验:CCK8结果显示5-8F Lv-miR-9外泌体诱导的HUVECs细增殖能力显著降低(P<0.001),CNE1 Lv-miR-9外泌体诱导的HUVECs细胞增殖能力显著降低(P<0.001);侵袭实验结果显示5-8F Lv-miR-9外泌体诱导的HUVECs穿膜细胞数减少78.11%(P<0.001),CNE1 Lv-miR-9外泌体诱导的HUVECs穿膜细胞数减少63.51%(P<0.001);成管实验结果显示5-8F Lv-miR-9外泌体诱导的HUVECs相对小管长度缩短65.00%(P<0.001),CNE1 Lv-miR-9外泌体诱导的HUVECs相对小管长度缩短56.86%(P<0.001);基质胶栓实验结果显示过表达miR-9组胶栓内新生血管显著少于对照组胶栓,过表达miR-9组外泌体诱导的HUVECs相对小管长度缩短68.18%(P<0.001)。4、靶基因预测及验证:靶基因筛选结果显示在由生物信息学软件预测的17个靶基因中,分泌型miR-9导致其中9个表达有差异,差异最显著的为MDK(t=37.500,P=0.001);双荧光素酶报告基因实验显示分泌型miR-9能与MDK 3’UTR特异性结合影响荧光活性(t=33.924,P=0.000),但不能与MDK mt 3’UTR结合(t=0.975,P=0.385)。瞬转miR-9 inhibitor,可以抑制分泌型miR-9与MDK 3’UTR结合,使荧光活性增强(t=26.077,P=0.001),对MDKmt3’UTR组荧光活性无影响(t=1.823,P=0.142);Western blot结果显示与对照组相比,过表达miR-9的外泌体诱导的HUVECs中MDK蛋白表达水平显著降低;抗体芯片结果显示与与对照组相比,过表达miR-9的外泌体诱导的HUVECs在PI3K/AKT信号通路上出现七个蛋白磷酸化水平下降,其中差异最显著的磷酸化蛋白P70S6k和PDK1在western blot上也得到了验证,而MAPK信号通路则未发现蛋白磷酸化改变5、免疫组化结果显示,慢性鼻咽炎鼻咽部上皮组织中MDK无表达,鼻咽癌组织中MDK胞浆表达;不同临床分期的标本中MDK表达差异具有统计学意义(P<0.001),在100例鼻咽癌标本中,相比于MDK低表达组而言,MDK高表达组中患者的T分期(P=0.001),N分期(P=0.005)和临床分期(P=0.001)均明显偏高;Kaplan-Meier生存分析显示鼻咽癌患者中MDK高表达患者(OS:53.33个月,95%置信区间:45.56-61.11;PFS:50.02个月,95%可信区间:41.51-58.52个月)的预后要显著差于MDK低表达患者(OS:78.13个月,95%置信区间:72.95-83.31个月;PFS:69.25个月,95%置信区间:62.81-75.69个月)。组间差异采用Log-rank检验分析,结果分别为OS:Log-rank= 14.923,P=0.0001;PFS:Log-rank= 10.205,P=0.0014。总体生存时间的多因素Cox比例风险模型的预后分析则显示:MDK表达水平可作为鼻咽癌总体生存期的独立不良预后因素(RR=0.351,P=0.030)结论1、鼻咽癌组织标本中miR-9表达强度与微血管密度呈负相关。2、鼻咽癌细胞分泌miR-9由外泌体介导进入血管内皮细胞。3、鼻咽癌分泌型miR-9抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力。4、鼻咽癌分泌型miR-9抑制血管生成的机制为作用于血管内皮细胞内靶基因MDK,从而抑制下游PI3K/AKT信号通路。5、鼻咽癌组织标本中MDK的表达水平可作为鼻咽癌患者预后不良的预测指标。更多还原

关 键 词： [8697749]MIR-9 [3774015]外泌体 [7480033]鼻咽癌 血管生成 肿瘤转移 [8679879]MDK [7622786]PI3K/AKT

分 类 号： [R739.63]

领　　域： []