导　　师： 李凌

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 南方医科大学

摘　　要： 目的:利用CRISPR/Cas9系统敲除4T1细胞中的整合素αvβ3基因，构建稳定敲除整合素αvβ3基因的4T1细胞株;分析阻断骨唾液酸蛋白(BSP)与整合素的结合后乳腺癌细胞增殖、迁移和粘附能力的变化，检测细胞内PI3K、AKT、ERK、NF-κB p65和IκBa表达水平和其磷酸化水平的变化，进而探讨阻断整合素表达抑制乳腺癌骨转移的作用。　　方法:(1)根据CRISPR/Cas9靶点设计原则，分别在整合素αv和β3亚基基因的外显子区域设计2条sgRNA，构建lentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒并转化至感受态Stbl3，筛选出重组质粒进测序验证后转染至HEK293Ft细胞包装成慢病毒。　　(2)慢病毒感染4T1细胞后用嘌呤霉素加压筛选稳定转染细胞，用有限稀释法分离培养单克隆细胞。　　(3)提取单克隆细胞基因组DNA后对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增并测序，用qRT-PCR检测稳定敲除细胞株整合素αv和β3亚基mRNA的表达，Western blot检测细胞株整合素αvβ3蛋白质的表达。　　(4)用CCK-8检测小鼠乳腺癌4T1细胞增殖活性，用划痕实验和transwell检测小鼠乳腺癌4T1细胞的迁移能力和用Caclein-AM检测小鼠乳腺癌4T1细胞的粘附能力。　　(5)用200ng/ml骨唾液酸蛋白(BSP)处理小鼠乳腺癌4T1细胞，于0h、6h、24h、48h收集细胞总蛋白，并用western blot检测细胞内PI3K、ATK、ERK、NF-κB p65和IκBa的表达水平及其磷酸化水平。　　结果:(1) lentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒构建成功，经过基因组DNA片段PCR扩增测序得一株缺失1bp的稳定敲除整合素αv亚基和一株缺失3bp的稳定敲除β3亚基的细胞株;细胞株整合素αv或β3亚基mRNA的表达量低，细胞株几乎无整合素αv或β3亚基蛋白质的表达。　　(2) CCK-8检测细胞增殖活性结果，0d、1d、3d、5d时敲除整合素αv亚基(T5)或敲除整合素β3亚基(T6)均抑制了小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖(P＜0.05)，其抑制作用比相应单个抗体（�

关 键 词： 乳腺癌 骨转移 细胞 整合素 骨唾液酸蛋白 基因 基因敲除

领　　域： [] []