导　　师： 杨世华

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 糖尿病（Diabetes mellitus）是以高血糖为主要特征的内分泌代谢性疾病,受遗传因素和环境因素影响。已经成为继心脑血管疾病、肿瘤疾病之后第三类严重危害人类健康的慢性非传染性疾病。近年来患病人数不断攀升,中国发病人数已经高居世界第一,数量高达1.14亿。而且各个国家糖尿病患者数量都呈日益增多的趋势,预计到2035年全球糖尿病患者将达到5.92亿人。PDX-1基因即胰腺十二指肠同源框1,一种在胰腺发育中起关键作用的特异性转录因子,影响胰腺的早期发育及晚期的分化,导致糖尿病的发生与发展。随着基因编辑技术的不断发展,基因编辑技术已广泛应用于小鼠、大鼠、兔子,猪和绵羊等不同物种,但都不能完全复制人类疾病,非人类灵长类动物与人类高度相似（97%）,因此非人类灵长类动物有潜力作为潜在的人类疾病模型。利用非人灵长类动物能更好的模拟疾病的发病机制和病理过程。CRISPR/Cas9技术因其简单,方便和高效的编辑效率得到广泛的应用。本实验就是通过应用CRISPR/Cas9技术研制PDX-1基因敲除猴,为研究糖尿病发病的分子机制提供依据。具体的实验设计,研究内容和结果如下。本实验根据NCBI上食蟹猴的PDX-1基因序列,针对第一外显子和第二外显子设计出8条sgRNA。在体外验证设计靶位点的活性。每次按比例混合1～3条sgRNA与Cas9,通过显微注射到食蟹猴胚胎胞质中,体外培养5～7天收回胚胎,在胚胎上检验活性。共收回27枚胚胎检测其中21枚发育到2细胞以上胚胎并做TA单克隆测序。随后运用内窥镜微创手术进行胚胎移植。移植两周后做B超筛查怀孕猴,怀孕3月左右对羊水较充裕身体状况较好的其中一只母猴进行腹部穿刺,抽取羊水做鉴定。解剖观察流产猴胰腺组织并用甲醛固定猴组织,分离组织后储存在-80℃。剪取小猴耳朵,提取皮肤DNA做测序,并进�

关 键 词： 研制 基因