导　　师： 季爱民

学科专业： J0702

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 南方医科大学

摘　　要： 肿瘤生长依赖于新血管生成,当肿瘤组织拥有独立的血管供应,肿瘤细胞就获得了转移扩散的能力。RNA干扰(RNA interference,RNAi)作为一项新兴技术,被广泛应用于恶性肿瘤的基因治疗研究领域。本课题设计合成cRGD-siVEGFR2分子,考察分子体外生物学功能,探讨其抑制血管生成的作用效果及作为肿瘤靶向治疗药物的可能性。方法1、原代人脐静脉内皮细胞模型的建立胶原酶消化法分离提取细胞,免疫荧光检测Ⅷ因子进行细胞鉴定,流式细胞术检测CD31含量进行纯度检测,并探索最佳的血清饥饿条件。2、cRGD-siRNA分子的合成cRGD通过linker与siRNA正义链5’端共价偶联得cRGD-siRNA分子,分别用液相色谱-质谱联用技术和反相高效液相色谱进行结构鉴定和纯度检测。3、cRGD-siVEGFR2分子体外功能研究(1)血清稳定性研究:siVEGFR2、cRGD-siVEGFR2、cRGD-siNC 分别与鼠血清混匀孵育,琼脂糖凝胶电泳后观察条带完整性。(2)细胞毒性研究:1000nM、2000nM、3000nMRPM 或 cRGD-siNC 分子转染细胞,CCK8测定细胞活力。(3)靶向沉默功能研究:100nM、500nM、800nM、1000nM cRGD-siVEGFR2、阳性对照 Lipo/siVEGFR2(100nM)、Lipo/cRGD-siVEGFR2(100nM)、阴性对照cRGD-siNC(1000nM)转染细胞,RT-PCR法和western-blot法检测分子靶向沉默效果。(4)对细胞增殖迁移的影响:100nM、500nM、800nM、1000nM cRGD-siVEGFR2、Lipo/siVEGFR2、cRGD-siNC 转染细胞,CCK8 法和 EdU 法测定细胞增殖活力,划痕实验和transwell实验测定细胞迁移能力。(5)对细胞体外成管的影响:1000nM cRGD-siVEGFR2、Lipo/siVEGFR2、cRGD-siNC转染细胞后接种于基质胶上进行细胞分化实验,观察小管形成情况。结果1、原代人脐静脉内皮细胞提取成功,细胞呈多边形,铺卵石状排列。Ⅷ因子呈阳性表达,CD31含量高为99.67%。不同血清浓度培养基饥饿培养细胞6h可得到70%左右G0/G1期细胞;12h可得80%～90%;18h、24h可得95%左右。2、cRGD-siRNA分子合成成功,其实测分子质量与理论分子质量基本一致,纯度约为80%。3、cRGD-siVEGFR2分子体外功能研究(1)血清稳定性:siVEGFR2分子24h几乎完全降解,而cRGD-siVEGFR2与cRGD-siNC分子72h仅有部分降解。(2)细胞毒性:RPM分子组O.D.值保持在1.0左右;cRGD-siNC组O.D.值保持在0.85以上,1000nM时O.D.值在1.0左右。(3)靶向沉默功能:cRGD-siVEGFR2分子可以下调VEGFR2mRNA和蛋白的表达,且其作用呈浓度依赖。(4)对细胞增殖迁移的影响:cRGD-siVEGFR2分子可呈时间和浓度依赖的抑制细胞增殖迁移。(5)对细胞体外成管的影响:HUVECs在基质胶上生长6h可形成条索状结构,生成分支,并闭合成管。cRGD-siVEGFR2分子可以有效减少管状结构形成。结论1、胶原酶消化法可收获高质量的HUVECs,无血清培养12h为最佳饥饿条件。2、cRGD通过linker与siRNA正义链5’端共价偶联,可得到纯度高、稳定性好、基本无毒的cRGD-siRNA分子。3、cRGD-siVEGFR2分子可以靶向沉默目的基因mRNA及蛋白的表达,有效抑制HUVECs的细胞增殖迁移及体外成管。更多还原

关 键 词： cRGD-siRNA [7889349]VEGFR2 基因沉默 [5194729]抗血管生成

分 类 号： [R97 R96]

领　　域： [] []