导　　师： 庾蕾

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 广州医科大学

摘　　要： 研究背景黄病毒属是一类通过蚊虫传播的RNA病毒。因我国南部地处热带亚热带地区,全年平均气温高,气候湿热,特别适合于各种虫媒性病原体的繁殖,成为急性虫媒病毒性传染性疾病的自然疫源区和发生地,尤其是广东省,出入境人流量大,因此本地输入和流行的风险极高。ZIKV为黄病毒属家族成员之一,自1947年首次分离出来至2007年以前因其温和性而鲜为人知。后于2007年在太平洋岛首次爆发后,间断有亚热带地区报道ZIKV的流行,随着疫情的爆发,神经系统并发症发生率在增加。在2015年末南美和中美洲的疫情中,巴西报道了几千例疑似新生儿小头症病例。截止至2017年底,共有80多个国家和地区报告了蚊子传播ZIKV感染的证据,而且还存在进一步扩大和跨境的风险。在我国2016年2月报道了第一例输入寨卡病例后,截至2017年5月,共有25例ZIKV感染病例,我国输入省份又以广东省最多为15例,占输入病例总数的60.0%。随着疫情的扩大,以及其侵害神经系统导致长远不良影响的特点,我国作为潜在自然疫情区,应储备好相应的诊治应对手段,尤其是早期快速可区分其他黄病毒的诊断。在早期诊断上,可以参考同为黄病毒属的重要成员之一——登革病毒,因我国南部已存在多个自然疫源地,在诊断方面,DENV诊断手段较ZIKV多且较成熟,除了核酸诊断外,DENV的免疫层析快速诊断在临床已成为初筛手段,其中包括了IgM/IgG以及NS1(non-structural protein 1,NS1)的胶体金免疫层析(GICA)快速检测。尤其是病毒抗原NS1,其作为来自DENV感染细胞的可溶性六聚体分泌,并在感染患者的血流中循环。NS1在病毒血症阶段可同时检测到,并且在病毒血症阶段后仍可检测到,提供比病毒RNA更长的诊断窗口,因此常常作为诊断靶标之一。快速准确的诊断对于疫情爆发时迅速的临床管理至关重要。因此无论在ZIKV还是DENV,联合早期快速检测,多策略进行诊断对疫情的控制无疑是增益的。第一部分寨卡病毒感染早期快速抗原检测方法的建立研究目的建立检测NS1抗原的免疫层析胶体金试纸方法,用于寨卡病毒(ZIKV)感染的早期诊断。研究方法对已获得的5株人源抗ZIKV NS1的单克隆抗体采用生物膜层光学干涉法进行抗体亲和力测定实验和竞争抑制实验,又通过两两随机组合配对方法筛选出最佳捕获抗体及包被抗体,制备成胶体金试纸。分别用重组NS1蛋白、感染ZIKV细胞培养上清液以及感染DENV病人血清/血浆多种检测样品以获得准确的特异性和敏感性。其中病毒定量采用FFA(Focus-Forming Assay,FFA)方法。研究结果1.抗体的配对及NS1抗原胶体金试纸的制备在亲和力测定实验中,5株抗体对ZIKV NS1有着较高的亲和力。通过竞争抑制实验,ZKns3G2、ZKns4B8抗体的抗原结合位点相似归为一类,另外3株抗体ZKns4F10、ZKns14G5、ZKns2E11的抗原结合位点相似归为另一类。通过随机配对原则,最终筛选以ZKns2E11为包被抗体,用胶体金标记的ZKns3G2为检测抗体,并成功构建胶体金试纸。2.胶体金试纸的敏感性与特异性鉴定在试纸敏感性分析中,用31.25ng/ml ZIKV重组NS1蛋白以及用2×10~4FFU/ml的ZIKV病毒量感染细胞所释放的NS1蛋白进行检测,该试纸条可在有效时间内读出阳性结果。试纸在其特异性上,无论是重组蛋白、感染病毒细胞培养上清液还是临床样本,与DENV均不交叉,表现出良好的特异性。结论1.从感染ZIKV恢复期患者分离获得的5株抗体与ZIKV NS1蛋白均有很强的结合活性;2.抗体根据结合位点可分为两类,一类为ZKns3G2和ZKns4B8,另一类为ZKns4F10、ZKns2E11、ZKns14G5;3.以ZKns2E11为包被抗体,以ZKns3G2标记胶体金作为捕获抗体制备的试纸条,具有较好的敏感性,可检测出31.25ng/mlZIKV重组NS1蛋白,且与DENV均不交叉,表现出良好特异性。可作为临床核酸诊断寨卡病毒病的补充,为DENV流行区ZIKV诊断提供技术储备。第二部分宿主免疫状态对NS1胶体金诊断的影响研究目的分析2018年7、8月临床出现的登革病毒感染的患者,其病毒抗原血症水平、宿主免疫状态及感染病毒株类型对早期诊断的影响。研究方法对2018年7、8月在广州市第八人民医院住院并通过RT-PCR确认的DENV-2感染的15名患者的实验室数据进行简单分析。收集到其中7名患者在住院期间的血清/血浆(其中漏诊病例收集了发病第5、6和32天血清/血浆),均进行NS1、IgM/IgG ELISA检测,分析患者体内NS1抗原以及抗体分泌水平。并对上述样本进行病毒RNA提取,后扩增及构建质粒,获取E、NS1全长序列。通过氨基酸序列比对以及进化树的绘制,获得可能的基因突变位点以及感染病毒株基因分型,进一步分析其对早期诊断的影响。研究结果1.临床资料的收集及整理收集的15例的实验室数据中,NS1快速检测的12个个体中有11个显示弱阳或阳性,且与其对应的RT-PCR结果一致。至于IgM/IgG快速检测,大多数病例(8/10)在第6天之前均为阴性。2.NS1和IgM/IgG ELISA检测漏诊病例(pt3)的第5、6天血清/血浆样本在NS1 ELISA检测方法中OD值分别为0.21和0.32(临界值=0.16),在IgM、IgG ELISA检测中均为阴性。仅第32天血浆样本在IgM ELISA检测中为阳性,而IgG检测中,第5、6、32天采集的血清/血浆均为阴性。而其他患者收集的样本中,IgM ELISA检测中5名患者为阳性但在快速检测中仅一个样本呈弱阳性,对于IgG ELISA检测中,有两名患者的血清/血浆样本为阳性,而快速检测为阴性。3.E、NS1基因序列的获得及分析成功从5份样本中扩增获得E基因序列,以及从4份样本中扩增获得的NS1基因序列,上传至Genbank数据库。在E序列及NS1序列的比对中,2018年分离获得的病毒株之间E、NS1蛋白氨基酸序列非常相似,仅仅只有几个氨基酸的不同,其中获得的E、NS1蛋白氨基酸序列中,有与pt3完全一致的。获得株均为DENV-2全球基因型,在基于E基因的分子进化树中获得株可为三个分支,其中从pt3分离的DENV-2病毒株所属的分支,与印度的2013年流行株(MH822956)亲缘性相近,另外两个分支中,分别与肯尼亚共和国2017年流行株(MG779202)及马来西亚2013年流行株(KJ806783)有较近的亲缘关系;在基于NS1基因的分子进化树中,根据获得序列可分为两个分支,其中一个分支(分别从pt3、pt2、pt6分离获得)与印度的2013年流行株(MH822956)亲缘性相近,另一分支(从pt10分离获得)与印度尼西亚2008年流行株(KC762671)亲缘性相似。结论1.宿主的免疫状态可以影响抗原快速检测的敏感性;2.从E蛋白序列分析表明,2018年DENV-2存在2个病毒株流行,均为全球性基因型,且本研究中病例均属于输入性病例,传播来源主要为东南亚地区;3.本研究中DENV-2感染者低NS1抗原血症能与宿主有关,提示对于高度疑似病例应采取多种策略以协助诊断。更多还原

关 键 词： 寨卡病毒 [136294]登革病毒 非结构蛋白1 [5922165]胶体金免疫层析法

分 类 号： [R511;R446.6]

领　　域： [] []