导　　师： 蔡更元;石俊松

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 体细胞核移植技术在畜牧、医学和生命科学等领域有重要应用价值，但一直以来低下的克隆效率限制了其应用。动物克隆的低效率主要归因于胚胎早期发育时期表观遗传重编程异常。三盐酸盐水合物BIX-01294是组蛋白H3K9甲基转移酶G9a的特异性抑制剂，研究表明使用BIX-01294抑制G9a活性，可显著提高猪体细胞核移植胚胎的发育效率。然而，BIX-01294处理克隆胚胎提高其早期体外发育效率的潜在机制尚不清楚。本实验用MTT法探究了BIX-01294对细胞活力的影响并筛选出合适的浓度，并利用合适的浓度处理细胞，比较各处理组的组蛋白甲基化酶相关基因和DNA甲基化酶相关基因的表达水平。然后采用“BIX-01294处理BIX-01294处理融合完成20h后的克隆胚24h、BIX-01294处理融合完成0h后的克隆胚16h”两种处理方案，在体外发育到囊胚阶段分别统计克隆胚胎体外发育效率，并收集囊胚，比较各组的组蛋白甲基化酶相关基因、DNA甲基化酶相关基因、相关功能基因的表达水平。　　试验结果如下：（1）随着BIX-01294浓度的增加，细胞生成抑制甚至致死。1μM以下的BIX-01294对耳皮成纤维细胞伤害较小。（2）BIX-01294处理猪耳皮成纤维细胞能够显著影响SUV39H1、SETdb1、DNMT1、DNMT3a基因的表达，但并不影响细胞中G9a、DNMT3b基因的表达。（3）BIX-01294显著下调二细胞、四细胞时期克隆胚胎的H3K9me2水平。（4）BIX-01294处理融合完成20h后的克隆胚胎24h，5nM处理组的囊胚细胞数显著提高;BIX-01294处理融合完成0h后胚胎16h，50nM处理组的囊胚细胞数显著提高,且50、500nM处理组的囊胚率与对照组相比显著提高。（5）利用BIX-01294处理克隆胚，能够显著影响SUV39H1、SETdb1、DNMT1、DNMT3a基因的表达，主要影响多能性基因(SOX2、OCT4、NANOG)以及KDM1a的mRNA水平表达，但并不影响胚胎中G9a、DNMT3b基因的表达。

关 键 词： 猪克隆胚胎 处理 甲基转移酶 细胞活力 发育效率

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