导 师: 王沂峰
授予学位: 博士
作 者: ();
机构地区: 南方医科大学
摘 要: 研究背景: Wnt信号通路持续激活参与了肿瘤干细胞特性的维持,是卵巢上皮癌复发及化疗耐药的关键机制之一。LGR6是富含亮氨酸的G蛋白偶联受体,被认为参与了经典Wnt信号通路的激活;但在卵巢上皮癌中,LGR6的临床意义、生物学功能以及其对Wnt信号通路的调控尚未阐明。 研究目的: 探讨LGR6在卵巢上皮癌组织中表达的临床意义;LGR6在卵巢上皮癌细胞中对肿瘤干细胞样特性维持、对化疗药物敏感性的影响,以及在此过程中LGR6对Wnt经典信号通路的影响。 研究方法: 1.用实时荧光定量PCR、免疫蛋白印迹、免疫组织化学等方法检测LGR6在卵巢上皮癌组织中的表达,分析294例卵巢上皮癌临床样品中LGR6的表达与化疗疗效、生存预后的关系。 2.通过siRNA建立稳定的LGR6低表达卵巢上皮癌细胞株,构建卵巢癌细胞模型,用无血清悬球培养法、流式细胞术分析侧群细胞比例、荧光定量PCR检测干细胞分子标记等方法,验证LGR6在诱导和维持肿瘤干细胞特性中的作用。 3.在卵巢上皮癌细胞模型中用CCK-8法、AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡、JC-1法测定线粒体膜电位、Caspase-9/-3底物活性测定法和免疫蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白与基因的表达活性等方法,观察各组卵巢上皮癌细胞对顺铂、紫杉醇的敏感性;在卵巢上皮癌细胞裸鼠皮下移植成瘤模型中,观察沉默LGR6对卵巢上皮癌细胞在体内对顺铂疗效的影响。 4.通过用免疫蛋白印迹法分析卵巢上皮癌细胞模型中β-catenin的入核情况、双荧光素酶报告基因检测系统检测TCF转录活性、荧光定量PCR法检测Wnt通路下游基因表达,探讨在卵巢上皮癌细胞中LGR6对经典Wnt通路激活的影响。在沉默了LGR6基因的卵巢上皮癌细胞中回补C33Y突变的β-catenin,验证经典Wnt信号通路参与了LGR6对卵巢上皮�