导　　师： 韩雅莉; 刘超

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 广东工业大学

摘　　要： 硅藻检验是迄今法医界公认的诊断溺死“金标准”。现今,法医实验室通常采用的硅藻检验方法为显微镜观察硅藻形态学法,但该法尚存诸多不足,如操作繁琐,耗时长和易于污染等。随着分子生物学的快速发展,PCR-CE检测水中浮游生物相关基因以助于准确确定溺死的方法,为法医学领域溺死诊断提供了新思路。目前,相关研究主要集中在检测水中一些浮游藻类特异性靶基因方面,而针对浮游细菌的研究尚少。实践发现不同水体条件溺死的尸体,其脏器组织内浮游生物的种类及数量均存在一定差异,仅针对单一物种的单个基因进行检测,在一定程度上存在检验效能不足或漏检的情况。因此,需要寻找更多浮游生物的可靠遗传标记,并建立能够同时对多种浮游生物的多个靶基因进行检测的复合扩增体系,以增强PCR-CE诊断溺死的实际应用效果。基于此,本文开展了系列研究,具体内容如下:(1)分别针对气单胞菌hly A、aer A及16S rRNA基因的同源序列,设计并筛选出3对特异性引物(hly A-2、aer-1和P16s),用该引物对人、3种人体共生细菌、9种浮游细菌及38种浮游藻类的DNA进行扩增检测。hly A-2特异性扩增嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌,产物片段为150 bp,灵敏度分别为0.034 ng,0.94 ng;aer-1特异性扩增杀鲑气单胞菌和温和气单胞菌,产物片段为180 bp,灵敏度分别为0.034ng,0.92 ng;P16s特异性扩增杀鲑气单胞菌和维氏气单胞菌,产物片段为668 bp,灵敏度分别为0.90 ng,0.013 ng。此外,建立了实验猪溺死模型,用筛选出的引物(hly A-2、aer-1及P16s)扩增检测16头实验猪的肺、肝和肾,总阳性率分别达80%,70%,50%,非溺死实验猪结果均为阴性。(2)结合本课题组前期研究,针对溺死相关浮游生物(硅藻、蓝藻、绿藻、甲藻及浮游细菌等)基因的同源序列,设计并筛选出14对特异性引物,用五色荧光染料对其进行分组标记,构建包含14个基因座的浮游生物相关基因复合扩增体系,该体系可特异性扩增35种浮游藻类和3种浮游细菌。复合扩增体系检测16头实验猪的肺、肝和肾,总阳性率达90%,非溺死实验猪结果均为阴性。(3)分别采用气单胞菌单基因PCR-CE检测法、浮游生物复合扩增体系及MD-VF-Auto SEM法检测了57例确定死因案件尸体的肺、肝和肾。引物hly A-2、aer-1及P16s总阳性率分别为81.48%,78.38%,51.85%,结合实验猪检测结果,分析确定hly A-2应用效果最佳;复合扩增体系和MD-VF-Auto SEM法检测案件总阳性率分别为96.30%,98.15%;经统计分析确定,复合扩增体系与MD-VF-Auto SEM法检测结果无统计学差异(P>0.05),但与气单胞菌hly A基因PCR-CE检测法的结果具有统计学差异(P<0.05)。通过本项研究,建立采用PCR-CE检测尸体脏器内气单胞菌hly A、aer A和16S rRNA基因诊断溺死的方法,丰富了分子生物学诊断溺死的遗传标记,为进一步建立浮游生物的复合扩增体系提供了可靠的靶向标记。在此基础上,建立了复合扩增体系,可对多种溺死相关浮游生物的13个不同基因片段进行检测,避免了仅对单基因进行PCR-CE检测可能存在漏检的问题。经检测证明,采用该复合扩增体系显著增加了对检测对象肝和肾的阳性率,提高了检测效率。此外,该方法所需检材量小,通量大,操作简便,易于在基层单位推广使用,因而在法医溺死诊断中具有良好的应用前景。更多还原

关 键 词： 溺死诊断 [5629092]基因检测 PCR-CE [6874649]复合扩增 [6842945]浮游生物

分 类 号： [Q173;D919]

领　　域： [] []