导　　师： 谈博

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 广州中医药大学

摘　　要： 目的（1）改良慢性束缚应激腹泻型肠易激综合征（irritable bowel syndrome with predominant diarrhea,IBS-D）大鼠模型,观察单一的慢性束缚应激因素对模型大鼠腹泻、内脏敏感性和离体肠道神经传导改变的影响,并明确神经传导异常的肠段。（2）观察广藿香配方颗粒、广藿香醇对IBS-D模型大鼠腹泻症状、内脏高敏感性及结肠神经传导异常的作用,探讨其对IBS-D发病相关的肠神经递质或受体基因表达的影响。（3）观察广藿香醇对IBS-D大鼠离体结肠纵行肌收缩张力与频率的影响,并考察其对胆碱能、氮能、嘌呤能神经传导通路的影响。方法采用慢性束缚应激诱导建立IBS-D大鼠模型,利用整体观察比较、分子生物学和神经生物学、电生理学等神经科学相关技术,从整体、器官、组织和分子水平进行系统研究。研究包括4个部分:（1）IBS-D模型的改良与评价:30只Sprague-Dawley大鼠,体重90-110g,分层随机分为3组（对照组、模型1 h组和模型2 h组）,每组10只,雌雄各半。造模方法:模型1 h组、模型2 h组,医用弹性网状绷带束缚大鼠的前上肢、前肩、胸部,时间分别为每天1 h和2 h,连续14天。造模开始后第7、14、21、28天,观察各组大鼠4 h粪便粒数、粪便面积、体质量变化;于第28天时,进行腹壁回缩反射（Abdominal Withdrawal Reflex,AWR）评分以评价内脏敏感性,采用苏木素—伊红（HE）染色法观察各组大鼠胃窦部、十二指肠、中段回肠、结肠组织病理改变,采用实时定量聚合酶链反应（real time quantitative polymerase chain reaction,qPCR）法检测结肠组织5-羟色胺3A受体(5-hydroxytryptamine-3A receptor,5-HT3AR)表达水平。（2）广藿香配方颗粒对IBS-D大鼠的药效学及其作用机制研究:采用上述改良方法建立IBS-D大鼠模型,72只大鼠随机分为正常组、模型组、阳性组（匹维溴铵组）、广藿香配方颗粒低、中、高剂量组,造模14 d后灌胃给药,每天1次,连续14天。定期测定各组大鼠的内脏敏感性、排便情况,末次给药后测定结肠匀浆5-HT3AR、5-羟色胺4受体（5-hydroxytryptamine-4 receptor,5-HT4R）、神经激肽1受体（neurokinin1 receptor,NK-1R）、神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase,nNOS）mRNA表达水平。（3）广藿香醇对IBS-D大鼠的药效学及其作用机制研究:采用慢性束缚应激诱导建立IBS-D大鼠模型,72只大鼠随机分为正常组、模型组、阳性组（匹维溴铵组）、广藿香醇低、中、高剂量组,造模14 d后灌胃给药,每天1次,连续14天。定期测定各组大鼠的内脏敏感性、排便情况,末次给药后测定结肠匀浆5-HT3AR、5-HT4R、速激肽前体1（tachykinin precursor 1,Tac1）、NK-1R、血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide,Vip）、nNOS mRNA表达水平。（4）广藿香醇对IBS-D大鼠离体结肠平滑肌神经传导的调控作用:在离体大鼠结肠纵行肌药理平台上,我们考察了广藿香醇对胆碱能、NO（氮能）和ATP（嘌呤能）不同的神经通路的作用。所用结肠平滑肌样本来自于前述IBS-D大鼠。CO2窒息法处死SD大鼠后,截取结肠与空肠置于37℃Kreb’s溶液,进行平滑肌张力试验。用LabChart软件记录广藿香醇累积浓度(3×10-7 mol/L1×10-4 mol/L)对大鼠结肠纵行肌自发性张力的影响,计算半数最大有效浓度(half maximal effective concentration,EC50)。以电场刺激（40 V,230 Hz,0.5 ms pulse duration,and 10 s）观察IBS-D大鼠结肠非肾上腺素能非胆碱能神经递质释放,测定Kreb’s液内的ATP水平。在预孵育广藿香醇（100μmol/L）后,观察并记录以下不同刺激条件下的张力变化:1)胆碱受体激动剂卡巴胆碱(10-9 mol/L10-5 mol/L);2)一氧化氮合酶（氮能）抑制剂L-NAME（10μmol/L）、P2Y1受体（嘌呤能）拮抗剂MRS 2500（1μmol/L）;3)P2受体（嘌呤能）激动剂α,β-me ATP（100μmol/L）;4)KCl（120mmol/L）。结果（1）IBS-D模型的改良与评价:与对照组比较,模型1h组大鼠在各时间点的的粪便粒数无明显变化（P>0.05）,仅在第14天的粪便面积显著升高,体重下降（P<0.05或P<0.01）。而模型2h组大鼠的粪便粒数、粪便面积在第21、28天均显著升高,体重在第7、14、21、28天均显著降低（P<0.05或P<0.01）。模型1 h、2 h组AWR评分均显著高于对照组（P<0.05）;两组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）。病理结果显示,与对照组比较,模型1h、2h组大鼠的胃、十二指肠、回肠、结肠组织样本均无明显的病理改变。qPCR结果显示,模型2h组结肠5-HT3AR表达水平显著高于对照组（P<0.05）,而模型1h组结肠5-HT3AR表达水平无显著变化（P>0.05）。（2）广藿香配方颗粒对IBS-D大鼠的药效学研究:与正常组比较,IBS-D模型组大鼠腹壁回缩反射评分增高、排便增加（P<0.01）,结肠组织的5-HT3AR、5-HT4R、NK-1R mRNA表达水平显著升高（P<0.05）,nNOS mRNA表达水平显著降低（P<0.01）。与模型组比较,广藿香配方颗粒低、中、高剂量组腹壁回缩反射评分降低、排便减少（P<0.05）,结肠组织的5-HT3AR、5-HT4R、NK-1R mRNA表达水平显著降低,nNOS mRNA表达水平显著升高（P<0.05或P<0.01）,对IBS-D模型大鼠有明显的治疗作用。（3）广藿香醇对IBS-D大鼠的药效学研究:与模型组比较,广藿香醇低、中、高剂量组腹壁回缩反射评分降低、排便减少（P<0.05）,结肠组织的5-HT3AR、5-HT4R、Tac1、NK-1R、Vip mRNA表达水平显著降低,nNOS mRNA表达水平显著升高（P<0.05或P<0.01）。（4）广藿香醇对IBS-D大鼠离体结肠平滑肌神经传导的调控作用:首先,广藿香醇对结肠平滑肌自主收缩有抑制作用,呈现剂量依赖性,EC50为41.9μmol/L。其次,广藿香醇能拮抗KCl所致的平滑肌收缩作用（P<0.05）;胆碱受体激动剂卡巴胆碱（CCh）所致平滑肌收缩亦可被广藿香醇拮抗,CCh的EC50上升39.87倍（0.94μmol/L→37.43μmol/L,P<0.05）。再次,当氮能通路被L-NAME（10μmol/L）阻断,应激模型大鼠结肠平滑肌会出现收缩（P<0.05）;但是,若提前孵育广藿香醇,可以拮抗这种收缩作用。因此,广藿香醇能抑制多种神经通路所致结肠平滑肌的收缩。但是,结果显示ATP（嘌呤能）神经通路似不参与该作用。结论广藿香醇是广藿香治疗IBS-D的主要有效活性成分,可明显改善IBS-D大鼠的腹泻症状及内脏高敏感性。该作用与调控肠神经传导有关,其机制可能是:针对IBS-D的结肠平滑肌组织,PA可能一方面增加nNOS mRNA表达水平、提高NO释放水平,另一方面竞争性拮抗胆碱能受体,此外还通过调节结肠神经递质5-HT表达等。广藿香醇的这种多靶点调节作用最终表现为对结肠过度收缩状态的抑制作用,是其缓解IBS-D腹泻症状的重要药理机制。更多还原

关 键 词： [6271565]广藿香醇 广藿香活性成分 肠易激综合征 [1944637]神经传导 [8974074]肠道平滑肌

分 类 号： [R285.5]

领　　域： []