导　　师： 田生礼

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 深圳大学

摘　　要： 里氏木霉(Trichoderma Reesei,T.reesei)是工业主要被用于生产纤维素酶的丝状真菌,但其合成纤维素酶受分解代谢物阻遏作用的调节,在有丰富碳源的环境中,不能合成纤维素酶,从而大大降低了纤维素酶工业生产的总体效率。目前研究发现,参与丝状真菌碳代谢阻遏作用的蛋白在构巢曲霉中有CREA,CREB,CREC和CRED,它们与里氏木霉中的CRE1,CRE2,CRE3和CRE4蛋白具有高度同源性。此前有过对CRE1,CRE2,CRE3和CRE4的研究,但这4个基因在里氏木霉中对纤维素酶的表达的协同作用机制尚不清楚。本文通过构建多靶向siRNA表达载体,对这4个基因进行同时多靶向沉默,探讨沉默分解代谢物阻遏对里氏木霉表达纤维素酶的调控机制,为研究里氏木霉中的分解代谢物阻遏物对表达纤维素酶表达的调控机制提供实验依据。本文在前期研究工作的基础上,获得了针对沉默分解代谢物阻遏基因cre2,cre3和cre4的siRNA片段,同时设计并研究了沉默分解代谢物阻遏基因cre1的siRNA,通过构建cre1基因的表达载体,转化里氏木霉QM9414,证明了沉默cre1基因的表达,可以显著提高里氏木霉表达纤维素酶和其酶活性。通过该实验获得了最佳沉默cre1基因的siRNA,为进一步研究同时沉默多靶向分解代谢物阻遏基因cre1,cre2,cre3和cre4奠定了基础。通过筛选的沉默cre1,cre2,cre3和cre4基因的4个最佳siRNA序列,设计并构建了A和B两种多靶向表达系统的载体,在里氏木霉中进行多靶向基因的沉默研究。实验结果表明,对里氏木霉进行多靶向基因沉默比单向基因沉默能够更充分的解除里氏木霉的碳代谢阻遏效应。在酶活性最高水平120 h时,多靶向基因沉默菌株的CMC酶活和滤纸酶活平均提高率是单基因沉默菌株T.reesei-cre1-T10的1.14倍和1.33倍。cbh1,egl1和xyr1基因的表达量比T.reesei-cre1-T10平均提高1.53倍、1.36倍和1.40倍。B表达系统中的T.reesei-cre4132在诱�

关 键 词： 分解代谢阻遏物 干扰 多靶向沉默 纤维素酶 表达调控

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