导　　师： 何国振

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 广州中医药大学

摘　　要： 阳春砂（Amomum villosum Lour.）来源于姜科豆蔻属,是多年生常绿草本植物,以其干燥成熟的果实春砂仁入药,是著名的“四大南药”之一,具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎的功效,为传统的大宗常用中药材,已有1300多年的应用历史。由于阳春砂特殊的花器官结构——假合蕊柱,阻碍了蜜蜂等媒介为之授粉,导致阳春砂的自然结实率极低,仅为1.17%,严重的限制了春砂仁产业的发展。道地产区阳春市多采用人工授粉以提高产量,但人工授粉劳动强度高,而且即使通过人工授粉平均亩产仍不足5 kg,这抑制了农户种植的积极性。如果能人为改变阳春砂的花器官结构,使蜜蜂等虫媒可以帮助授粉,提高自然授粉率,从而提高阳春砂的产量,将有利于扩大春砂仁的生产,解决当前供不应求的市场现状,同时减少生产种植成本,提高农民的收入。本课题组陈红研究发现,阳春砂的假合蕊柱结构是在阳春砂小花生长发育过程中雌雄蕊的相对运动形成的。因此,本文在陈红的研究基础上进一步研究阳春砂花丝、花柱的运动机理,以期为改变阳春砂花器官结构的研究奠定基础,为提高阳春砂自然授粉率提供理论根据。研究结果如下:（1）研究了阳春砂花丝、花柱运动的结构基础和运动发生的部位以及时间采用陈红建立的阳春砂小花生长时期的划分标准,按照长度从0.5 cm的小花开始,每伸长0.5 cm为一个时期,至开花后一天共划分为07个不同的生长时期:第0时期、第1时期、第2时期、第3时期、第4时期、第5时期、第6时期、第7时期。第6时期为开花当天,第7时期为花后一天。通过制作不同生长时期的花丝、花柱的石蜡切片,测定了花丝和花柱在不同生长时期的细胞大小和分布。发现阳春砂花丝的运动是由于花丝远近轴侧细胞生长速率的不平衡导致的,并且这种运动是从花丝形态学上端至形态学下端依次发生的。03时期,花丝各部位远轴侧细胞基本均大于近轴侧,且超过近轴侧3.52%56.00%;到了第4时期和第5时期,花丝部位4、5近轴侧的细胞比远轴侧大7.15%29.84%;到了第6时期,花丝近轴侧各部位的细胞大小均大于远轴侧,且超过远轴2.24%21.38%,花丝已经完全由近轴侧向远轴侧弯曲。因此,花丝的弯曲运动是由于远近轴侧细胞增大的速率不平衡导致的,运动发生时间主要始于第34时期,运动发生的部位始于形态学上端的部位4和部位5,逐渐向形态学下端延伸。阳春砂花柱的运动是由于花柱远近轴侧细胞的分布以及生长速率的不平衡导致的。花柱远近轴侧的结构是不对称的,近轴侧比远轴侧多了46层较大的薄壁细胞。在小花生长发育的全过程中,同一部位近轴侧细胞均显著大于远轴侧。不同时期部位1、2、3远近轴侧细胞大小相差不大;部位4、5近轴侧细胞比远轴侧细胞大25.36%115.99%。小花在第34时期开始,部位5远近轴侧细胞迅速增大,近轴侧细胞增大71.67%,远轴侧细胞增大25.04%;到了第56时期,部位4近轴侧细胞迅速增大31.92%,远轴侧细胞增大18.33%,部位4、5近轴侧细胞增大的速率均大于远轴侧,导致花柱近轴侧生长速率大于远轴侧,并且由近轴侧向远轴侧运动。因此,花柱由弯曲变直的过程也是起始于34时期,运动发生的部位主要在部位4和部位5。远近轴侧细胞形态的不对称是其运动的基础,细胞生长速率的不平衡是其运动的根本原因。（2）研究了四种植物激素在花丝、花柱中的分布和相对含量通过免疫组化的方法测定了不同生长时期花丝、花柱中IAA、GA3、CTK、ABA的相对含量和分布特性。34时期,花丝远近轴侧IAA含量均显著下降,近轴侧下降了52.05%,远轴侧下降了91.34%,远轴侧IAA含量下降的速率远大于近轴侧,导致远轴侧细胞的生长速率小于近轴侧;远轴侧CTK含量下降37.14%,而近轴侧CTK含量仅下降3.74%,远轴侧细胞分裂能力迅速减弱,花丝近轴侧细胞分裂活跃,细胞数目增多;近轴侧GA3相对含量上升了12.02%,而远轴侧GA3含量下降了7.05%,使近轴侧细胞生长速率大于远轴侧。因此,可能是IAA、CTK、GA3三者的共同作用,促进了近轴侧细胞体积的增大和细胞数目的增多,最终导致花丝从34时期开始,由近轴侧向远轴侧弯曲运动。13时期,花柱远轴侧高浓度IAA、GA3、ABA抑制了细胞体积的增大,导致远轴侧细胞均小于近轴侧;但花柱远轴侧高浓度的IAA和GA3协同高浓度的CTK促进了远轴侧细胞分裂,使远轴侧细胞数目增多且超过近轴侧,花柱呈现由远轴侧向近轴侧弯曲的形态。34时期开始,花柱近轴侧IAA、GA3和ABA下降到适宜的浓度,对近轴侧细胞生长的抑制作用解除,而远轴侧IAA和GA3持续上升了21.61%和33.21%,对远轴侧细胞生长的抑制增强;近轴侧CTK含量升高12.86%,且显著高于远轴侧,使近轴侧细胞分裂比远轴侧活跃,细胞数目迅速增多;因此,可能是IAA、CTK、GA3、ABA四者的共同作用,促进花柱近轴侧细胞体积增大和数目增多,使花柱近轴侧快速伸长,导致花柱从34时期开始,由近轴侧向远轴侧运动,最终由弯曲形态变竖直。（3）获得了阳春砂花丝、花柱的转录组信息由于现今在NCBI中未有阳春砂的参考基因组或转录组序列,若想利用表达谱测序的方法研究花丝、花柱在弯曲运动前后基因表达量的变化,则必须构建一个总样品的转录本作为参考序列。因此我们提取17时期花丝、花柱的总RNA,然后等量混合,通过质检后利用Illumina测序技术进行测序,获得花丝、花柱总的转录组信息。共获得94584个unigenes,其中共有62174个unigenes被注释,注释率为65.73%。有1656个unigenes注释到植物激素信号转导途径。其中注释到生长素信号转导途径的unigenes有329个;注释到赤霉素信号转导途径的unigenes有438个;注释到细胞分裂素信号转导途径的unigenes有245个;注释到脱落酸信号转导途径的unigenes有168个;注释到油菜素内酯信号转导途径的unigenes有191个;注释到茉莉酸信号转导途径的unigenes有176个;注释到水杨酸信号转导途径的unigenes有74个;注释到乙烯信号转导途径的unigenes有139个。进一步对转录组数据进行挖掘,有42个unigenes注释到生长素生物合成酶基因;有50个unigenes注释到赤霉素生物合成酶基因;有45个unigenes注释到细胞分裂素生物合成酶基因;共有13个unigenes注释到茉莉酸生物合成酶基因;有18个unigenes注释到油菜素内酯生物合成酶基因;有29个unigenes注释到脱落酸生物合成酶基因;有24个unigenes注释到水杨酸生物合成酶基因;共有23个unigenes注释到乙烯生物合成酶基因。（4）获得了不同生长时期花丝、花柱的表达谱,筛选出了可能调控花丝、花柱运动的关键基因以获得的阳春砂花丝、花柱的转录组作为参考序列,对不同时期花丝、花柱分别单独进行表达谱测序分析。提取17时期花丝、花柱的总RNA,通过质检后采用BGI-Seq500测定不同生长时期花丝、花柱的基因表达谱,关注17时期花丝、花柱激素合成酶以及信号转导关键因子基因表达量的变化,并且筛选出了大量可能调控花丝、花柱弯曲运动的差异表达的基因。第34时期是花丝、花柱运动发生的起始时间。34时期,花丝中AUX1基因上调表达,GA20ox、GA3ox、TCH4、CYCD3基因下调表达;花柱中AUX1、CKX、B-ARR、GA2ox、PIF4、CYP85A2、BKI1基因上调表达,TAA1、CPS、GA3ox、GID2基因下调表达。这些差异表达的基因可能是调控花丝、花柱运动的关键基因。通过对相同时期花丝、花柱差异表达基因富集性分析发现,相同时期在花丝与花柱激素生物合成和信号转导途径中共有差异表达的基因有AUX1、GH3、ARF、AUX/IAA、SAUR、B-ARR、KS、KO、KAO、GA3ox、GA2ox、PIF3、GID2、AOC、AOS、JAR1、JAZ、CYP85A2、CYCD3、BRI1、BKI1、TCH4、BAK1、AO、ZEP、NCED、NPR1、PR-1、ACS、ACO、SIMKK,且除了KS基因外,相同时期,相同基因在花丝和花柱中差异表达完全趋势均相同,因此说明这些差异表达的基因对花丝和花柱的运动有着重要的调控作用,并且这种调控是同步的。利用RT-PCR法对花丝、花柱中3个赤霉素生物合成酶基因和2个赤霉素信号转导因子的相对表达量进行了分析,发现花丝、花柱GA3ox、GA20ox、GA2ox等基因的相对表达量的变化趋势与表达谱测序数据中对应基因表达量的变化趋势一致,并且呈显著正相关,说明表达谱测序的数据是真实可靠的。（5）分析了阳春砂花丝、花柱在生长发育过程中部分激素生物合成酶基因表达量与相应激素含量的相关性将不同生长时期的花丝、花柱中生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸生物合成酶基因的表达量以及与花丝、花柱远近轴侧IAA、CTK、GA3、ABA的相对含量做相关性分析,发现大多数相同的酶基因在花丝与花柱中的表达量呈极显著正相关,说明花丝与花柱的运动之间有着较强的关联性。激素生物合成酶基因的表达量与花丝、花柱远近轴侧激素的相对含量部分呈现正相关,说明在花丝、花柱的生长发育过程中,激素合成酶基因的表达与相应激素的含量存在一定的相关性。总结以上研究结果,阳春砂花丝、花柱运动的起始时间均为34时期,花丝运动的起始部位是部位4和部位5,并且由形态学上端向形态学下端延伸;花柱运动的部位主要集中在形态学上端的部位4和部位5。阳春砂花丝在34时期发生弯曲运动的机制可能是:GA3含量的上升,AUX1基因的上调表达,两者共同促进了花丝近轴侧的生长;GA3ox、GA20ox的下调表达,使远轴侧GA3含量下降,同时IAA和CTK的含量也下降,三者共同抑制了花丝远轴侧的生长,最终导致花丝近轴侧生长速率超过远轴侧,并由近轴侧向远轴侧弯曲运动。阳春砂花柱在34时期发生弯曲运动的机制可能是:GA2ox基因上调表达,GA3ox、GA20ox基因下调表达使花柱近轴侧GA3含量下降,高浓度的GA3对近轴侧生长抑制解除,同时CTK、IAA含量上升,B-ARR、AUX1基因上调表达,促进了花柱近轴侧的生长;而GA3含量的上升,PIF4基因上调表达,ABA含量的上升,三者共同抑制了花柱远轴侧的生长,最终导致花柱由近轴侧向远轴侧运动,最终变直。更多还原

关 键 词： [837698]阳春砂 [5454080]花丝 [5455546]花柱 [5683252]激素 免疫组化 [3467282]转录组 [8739899]表达谱

分 类 号： [S567.239]

领　　域： []