导　　师： 李先涛

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 广州中医药大学

摘　　要： 目的:以高脂血症痰浊证大鼠为研究对象,采用高通量测序技术探讨化痰降浊方及其拆方干预高脂血症痰浊证的作用机制,从糖代谢、脂代谢、炎症介质方面研究化痰降浊方调控高脂血症痰浊证的作用靶点。方法:(一)高脂血症痰浊证大鼠动物模型的复制、给药及评价将150只雄性SD大鼠随机分为正常组10只和模型组140只,分别用普通饲料和高脂饲料喂养30天后,检测所有大鼠的血脂四项,评价模型的建立情况。再将模型组按血清TC值随机分为病证对照组、西药对照组、全方低中高剂量组、苍术-白术低中高剂量组、陈皮-半夏低中高剂量组和茯苓-泽泻低中高剂量组。按相应的给药方案给药4周后,取血检测血脂四项,评价各组干预后的效应。(二)“化痰降浊方”的作用机制研究取正常对照组、病证对照组、西药对照组以及全方和拆方高剂量组大鼠的肝脏组织,提取mRNA进行转录组高通量测序,筛选差异表达基因,研究化痰降浊方及其拆方对高脂血症痰浊证的作用机制。结果:(一)高脂血症痰浊证大鼠病证结合动物模型的复制150只雄性SD大鼠造模30天后,模型组TC和TG水平升高,HDL-C水平降低,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),符合混合型高脂血症动物模型的标准,提示成功复制混合型高脂血症动物模型。随机分组后病证对照组与各给药组间血脂四项水平差异均无统计学意义(P>0.05),提示给药前各组间血脂水平基线一致,具有可比性。给药4周后,病证对照组的TC、LDL-C升高,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);病证对照组大鼠的“痰浊证”指标:体重、肝脏湿重、肝系数和Lee’s指数(肥胖程度)均升高,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。综合血脂水平和“痰浊证”指标,可认为成功复制高脂血症痰浊证病证结合动物模型。(二)化痰降浊方及其拆方的干预效应1.降血脂结果给药4周后,大鼠TC水平:西药组、全方高剂量组、陈皮-半夏低剂量组、茯苓-泽泻高剂量组降低,与病证对照组比较,差异均有统计意义(P<0.05);TG水平:苍术-白术高剂量组和茯苓-泽泻高剂量组降低,与病证对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);HDL-C水平:苍术-白术中剂量组和茯苓-泽泻高剂量组升高,与病证对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。根据《辅助降血脂功能评价方法》,判定化痰降浊方为辅助降低血清胆固醇功能动物实验结果阳性,茯苓-泽泻为辅助降低血脂功能动物实验结果阳性,西药、陈皮-半夏为辅助降低血清胆固醇功能动物实验结果阳性,苍术-白术为辅助降低血清甘油三酯功能动物实验结果阳性。2.其他指标(1)体重:苍术-白术高剂量组降低,与病证对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);(2)体长:苍术-白术低、中剂量组、陈皮-半夏低剂量组和全方中剂量组降低,与病证对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);(3)肝脏湿重:全方高剂量组、陈皮-半夏高剂量组和茯苓-泽泻高剂量组降低,与病证对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);(4)肝系数:全方高剂量组降低,与病证对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);(5)Lee’s指数:苍术-白术高剂量组降低,与病证对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明,化痰降浊方及其拆方具有较好的控制大鼠血脂水平的作用,尤其以茯苓-泽泻降血脂效果最好。(三)转录组测序结果1.各组大鼠肝脏样品提取的RNA及构建的文库经质量检测都达到标准,测序得到的Reads与参考基因组的比对效率较高(73.76%~83.81%)。2.差异基因筛选结果根据筛选指标:FC(Fold Change)≥1.5和FDR(False Discovery Rate)<0.05,病证对照组mRNA与正常对照组比较,上调1704个,下调798个;各给药组mRNA与病证对照组比较:西药组下调4个;全方组上调1088个,下调848个;苍术-白术组上调10个,下调11个;陈皮-半夏组上调103个,下调275个;茯苓-泽泻组上调434个,下调776个。3.糖代谢调节作用(1)化痰降浊方可通过激活Ldha、Insr和抑制Aldh1b1、Gck、Uap1l1、Ldhd、Pklr、Srebf1、Cblc和Abcc8的表达调节糖代谢,涉及戊糖与葡萄糖醛酸酯互变、半乳糖代谢、抗坏血酸盐和醛糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、丙酮酸代谢、丙酸代谢、AMPK信号通路、胰岛素信号通路和胰岛素分泌10条通路;(2)茯苓-泽泻可通过抑制Pfkp、G6pd、Aldh1b1、Akr1b1、Hk2、Hk3、Nagk、Gnpda1、Pkm、Ldhb、Me2、Ldhd、Pklr、Oxct1、Pik3cg、Pip4k2a、Pik3cd、Inpp5d、Synj2、Plcg2、Pik3r5、Scd2、Cblc、Slc2a1、Camk2d、Prkcb和Kcnn4的表达调节糖代谢,涉及戊糖磷酸途径、戊糖与葡萄糖醛酸酯互变、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢、抗坏血酸盐和醛糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、丙酮酸代谢、丙酸代谢、丁酸酯代谢、磷酸肌醇代谢、AMPK信号通路、胰岛素信号通路和胰岛素分泌14条通路;(3)陈皮-半夏可通过激活Insr和抑制Aldh1b1、Pkm、Me2、Pklr、Pik3cd、Srebf1、Scd2、Cblc的表达调节糖代谢,涉及戊糖与葡萄糖醛酸酯互变、抗坏血酸盐和醛糖代谢、丙酮酸代谢、磷酸肌醇代谢、AMPK信号通路和胰岛素信号通路6条通路;(4)苍术-白术可通过抑制Aldh1b1的表达调节糖代谢,涉及戊糖与葡萄糖醛酸酯互变、抗坏血酸盐和醛糖代谢和丙酮酸代谢3条通路。(5)糖代谢小结:全方和拆方均能抑制Aldh1b1的表达;另外,全方和茯苓-泽泻、陈皮-半夏均能抑制Pklr、Cblc的表达;全方和茯苓-泽泻均能抑制Ldhd的表达;全方和陈皮-半夏均能激活Insr的表达,抑制Srebf1的表达。4.脂代谢调节作用(1)西药阿托伐他汀可通过抑制Pla2g2d的表达调节脂代谢,涉及甘油磷脂代谢、醚酯代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢和α-亚油酸代谢5条通路;(2)化痰降浊方可通过激活Acot2、Acot3、Acox1、Dhcr24、Lss、Cyp3a9、Pnpla7、Ptdss2、Ept1、Cyp4a1、Cyp4b1和抑制Cyp7a1、Aldh1b1、Chka、Asah2的表达调节脂代谢,涉及脂肪酸延长、脂肪酸代谢、类固醇生物合成、初级胆汁酸合成、甾类激素合成、甘油酯代谢、甘油磷脂代谢、醚酯代谢、鞘脂类代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、α-亚油酸代谢、不饱和脂肪酸合成、PPAR信号通路14条通路;(3)茯苓-泽泻可通过激活Acot2、Acot3、Dhcr24、Cyp3a9、Pnpla7、Ept1和抑制Ppt1、Ppt2、Scd2、Cyp7a1、Cyp7b1、Aldh1b1、Akr1b1、Pla2g4a、Lpcat2、Pla2g2d、Pla2g16、Pld4、Asah2、Hpgds、Ptgs1、Tbxas1、Olr1的表达调节脂代谢,涉及脂肪酸延长、脂肪酸代谢、类固醇生物合成、初级胆汁酸合成、甾类激素合成、甘油酯代谢、甘油磷脂代谢、醚酯代谢、鞘脂类代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、α-亚油酸代谢、不饱和脂肪酸合成、PPAR信号通路14条通路;(4)陈皮-半夏可通过激活Acox1、Cyp2b1、Ept1、Cyp4b1和抑制Scd2、Cyp7b1、Aldh1b1、Pla2g16、Pla2g7、Pltp的表达调节脂代谢,涉及脂肪酸代谢、初级胆汁酸合成、甾类激素合成、甘油酯代谢、甘油磷脂代谢、醚酯代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、α-亚油酸代谢、不饱和脂肪酸合成、PPAR信号通路11条通路;(5)苍术-白术可通过抑制Aldh1b1、Pla2g2d,涉及甘油酯代谢、甘油磷脂代谢、醚酯代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢和α-亚油酸代谢6条通路。(6)脂代谢小结:全方和拆方均能抑制Aldh1b1的表达;另外,全方和茯苓-泽泻、陈皮-半夏均能抑制Ept1的表达;全方和茯苓-泽泻均能激活Acot2、Acot3、Dhcr24、Cyp3a9、Pnpla7的表达,抑制Cyp7a1、Asah2的表达;全方和陈皮-半夏均能激活Acox1、Cyp4b1的表达。5.炎症介质通路调节作用(1)化痰降浊方可通过抑制Cblc、Cdc25b的表达减少炎症反应,涉及Jak-STAT信号通路、MAPK信号通路2条通路;(2)茯苓-泽泻可通过抑制Pim1、Il3ra、Ifngr2、Il2rg、Pik3cg、Stat1、Ptpn6、Il21r、Il10ra、Pik3cd、Jak3、Il15ra、Cblc、Pik3r5、Cish、Il2rb、Csf2ra、Crlf2、Pla2g4a、Dusp10、Rasgrp1、Ptpn7、Rac2、Prkcb、Dusp5、Stmn1、Fas、Nfkb2、Jund、Map4k1、Tgfb1、Pak1、Relb、Rras、Flna、Birc3、Nfkbia、Lyn、Lck、Ccl4、Syk、Ccl19、Zap70、Cd40、Ccl21、Bcl2a1、Traf1、Tnfaip3、Plcg2、Btk的表达减少炎症反应,涉及Jak-STAT信号通路、MAPK信号通路、NF-kappa B信号通路3条通路;(3)陈皮-半夏可通过抑制Il2rg、Pik3cd、Cblc、Il2rb、Csf2ra、Stmn1、Map4k1、Pak1、Lck、Syk、Zap70、Ccl21、Bcl2a1的表达减少炎症反应,涉及Jak-STAT信号通路、MAPK信号通路、NF-kappa B信号通路3条通路。(4)炎症介质小结:全方和茯苓-泽泻、陈皮-半夏均能抑制Cblc的表达。6.Q-PCR验证结果选择调节脂质代谢的关键基因:CYP7A1、LXRα、PPARγ和SREBP1-c做Q-PCR验证。化痰降浊方组和茯苓-泽泻组四个基因的表达量均降低,和病证对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);苍术-白术组SREBP1-c基因表达量降低,和病证对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。验证结果与转录组测序结果基本一致。结论:(一)用高脂饲料喂养SD大鼠30天能成功复制高脂血症痰浊证病证结合动物模型,化痰降浊方及其拆方均能有效控制高脂血症痰浊证大鼠的血脂水平,效果与西药相当。方中的茯苓-泽泻在降血脂方面效果最好。(二)初步揭示了化痰降浊方的作用机制1.在调节糖代谢方面:全方和拆方均能抑制Aldh1b1的表达;另外,全方和茯苓-泽泻、陈皮-半夏均能抑制Pklr、Cblc的表达;全方和茯苓-泽泻均能抑制Ldhd的表达;全方和陈皮-半夏均能激活Insr的表达,抑制Srebf1的表达。2.在调节脂代谢方面:全方和拆方均能抑制Aldh1b1的表达;另外,全方和茯苓-泽泻、陈皮-半夏均能抑制Ept1的表达;全方和茯苓-泽泻均能激活Acot2、Acot3、Dhcr24、Cyp3a9、Pnpla7的表达,抑制Cyp7a1、Asah2的表达;全方和陈皮-半夏均能激活Acox1、Cyp4b1的表达。3.在调节炎症介质方面:全方和茯苓-泽泻、陈皮-半夏均能抑制Cblc的表达。更多还原

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