导　　师： 王斌

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南理工大学

摘　　要： 葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,EC 1.1.3.4,GOD)是一种黄素依赖型氧化还原酶,它能专一的催化β-D-葡萄糖分解成葡萄糖酸内酯和过氧化氢。葡萄糖氧化酶在纺织业、畜牧业、食品业、医疗医药业等众多领域均有广泛的应用。目前食品级葡萄糖氧化酶的工业生产产量不高,发酵副产物比较多,不利于分离纯化,这些问题对食品级葡萄糖氧化酶的发酵生产产生了不利影响。本文选择黑曲霉CBS513.88的葡萄糖氧化酶基因之一goxC,通过密码子优化、信号肽替换对GOD编码区进行改造,提高发酵液酶活;同时以实验室前期构建的低蛋白背景菌黑曲霉SH2和HL1为出发菌株,利用营养缺陷标记pyrG构建葡萄糖氧化酶表达载体系统,进一步提高GOD的分泌表达。主要结论包含以下几方面:(1)以SH2为宿主的葡萄糖氧化酶重组表达:从NCBI中找到Aspergillus niger CBS513.88中葡萄糖氧化酶相关的4个基因,通过文献查找、BLAST分析及进化树分析选择goxC基因,以SH2为宿主构建GOD重组菌株。通过邻联茴香胺-过氧化氢酶法,测转化子的酶活,发现SH2-goxC5号转化子酶活最高,在第7d时可达563.8 U/mL;50L上罐发酵在179h时酶活为最高,高达1128 U/mL,相比摇瓶提高了2倍多。(2)以HL1为宿主的葡萄糖氧化酶重组表达:为了探究敲除转录因子prtT及一系列淀粉酶对黑曲霉发酵培养中营养物质利用的影响,以未敲除prtT基因的HL1作为出发菌来构建葡萄糖氧化酶高效表达重组菌株,筛选出表达量最高的HL1-goxC9号转化子,达到635.1U/mL。同时通过0%%葡萄糖浓度的摇瓶发酵并检测酶活探究葡萄糖浓度对发酵的影响,发现0%葡萄糖浓度的摇瓶在72h时酶活力达到最高为658.3 U/mL,1%葡萄糖浓度的摇瓶在120h时酶活力达到了599.3 U/mL,发现随着培养基中葡萄糖浓度的提高,达到最高酶活的小时数也随之延长。(3)葡萄糖氧化酶酶学性质研究:通过亲和层析纯化葡萄�

关 键 词： 黑曲霉 重组表达 葡萄糖氧化酶 发酵条件优化

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