导　　师： 韩双艳

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 华南理工大学

摘　　要： 天然活性多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和免疫调节等生物活性,可广泛应用于医药、保健品和化妆品等行业。具有免疫活性的多糖主要来源于植物、动物及微生物中,其中微生物多糖与其它来源的多糖相比,最大的优势在于不受季节、地域和病虫害的限制。酿酒酵母细胞壁55%~65%为葡聚糖,20%为甘露聚糖,并且其具有清晰明朗的遗传背景,工业应用技术成熟,不产生有毒物质,被美国FDA确认为安全性生物,所以成为活性多糖的理想来源。在实际生产中,通过施加压力(渗透压、营养限制、极端pH等)来调控酿酒酵母细胞壁多糖的合成,不仅需要更高的生产成本及工艺条件,往往还难以实现对整个过程的控制。因此通过酿酒酵母细胞壁多糖合成途径的研究,构建非压力诱导即可自身高产多糖的酵母菌株显得尤为必要。本课题首先探究了细胞壁葡聚糖合成途径中的β-1,3-葡聚糖合成酶Fks1及其调节亚基Rho1对细胞壁多糖合成的影响。本研究从酿酒酵母基因组中PCR扩增出其自身内源的Fks1及Rho1基因片段,构建了pUG6-rDNA-Fks1和pUG6-rDNA-Rho1这两种rDNA位点整合型过表达质粒,将重组质粒电转入酿酒酵母感受态中,结合荧光定量PCR分析,成功构建了Fks1及Rho1基因过量表达菌株BY4743/Fks1和BY4743/Rho1,它们的转录水平分别提高了3.38和2.63倍。另外,从酿酒酵母BY4743基因组中PCR扩增出Fks1活性中心的上下游同源臂,通过融合PCR将其与KanMX抗性形成基因敲除盒,通过电转导入酿酒酵母感受态中,结合Real-time PCR分析,成功构建了Fks1活性中心敲除菌株BY4743/△Fks1,敲除区域几乎没有转录量。以上重组酿酒酵母细胞壁内多糖组分,经离子交换色谱测定分析发现:Fks1及Rho1基因过量表达对细胞壁多糖的含量没有影响,Fks1基因活性中心的敲除,葡萄糖含量下降了25.99%,甘露糖含量提高了18.09%,N-乙酰葡糖胺含量提高

关 键 词： 酿酒酵母 葡聚糖 信号途径

领　　域： []