导　　师： 陆海

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 北京林业大学

摘　　要： 半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease)是一类十分庞大的蛋白酶家族,广泛参与蛋白质水解及叶片衰老等植物PCD进程。本研究以毛果杨作为实验材料,通过结构分析、实时定量PCR、原核诱导表达以及转基因等技术,深入探讨分析了五个毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因的组织表达、蛋白特性以及转基因拟南芥在干旱胁迫条件下的萌发与发育情况。本研究主要对PtCP2、PtCP3、PtCP4和PtCP5进行生物信息学分析,主要包括以下内容：使用SignalP3.0软件对信号肽序列进行预测和分析,使用BioEdit软件对氨基酸序列进行比对分析等。根据结果推测,PtCP2和PtCP4属于RD19A-like类的木瓜蛋白酶,3tCP3和PtCP5属于CTB3-like类的木瓜蛋白酶。利用实时定量PCR技术对PtCP2、PtCP3、PtCP4和PtCP5进行了组织表达定位分析。结果显示,PtCP2、PtCP3、PtCP4和PtCP5均主要在毛果杨根部和叶部进行表达,在茎中表达量偏低,分析该基因家族功能可能与干旱胁迫相关。通过原核表达技术对半胱氨酸蛋白酶PtCP2、PtCP3、PtCP4和PtCP5进行了体外诱导表达,并通过包涵体洗涤法对重组蛋白进行了体外纯化。结果显示,PtCP2、 PtCP3、PtCP4和PtCP5在原核表达系统中通过IPTG诱导均可大量表达,切除信号肽后分子量分别约为38.2 kD、36.7kD、38kD和36.7kD,经纯化后,可以在体外获得大量、单一的重组蛋白。进一步尝试在酸性条件中实现酶原蛋白的自催化成熟,但未能取得成功,显示这四个半胱氨酸蛋白酶的酶原激活过程可能不是由蛋白酶自身进行自催化完成,而是由其他蛋白酶催化激活。分别构建了含五个半胱氨酸蛋白酶基因的正义转基因载体,并通过花序侵染法对野生型拟南芥进行转基因侵染,成功获得PtCP1和PtCP5的转基因拟南芥株系。对PtCP5转基因拟南芥进行了正常条件下和干旱胁迫条件下萌发率及主根长度的检测与分析。结果显示,与野生型相比,PtCP5转基因拟南芥根系明显发达,同时PtCP5转基因拟南芥在甘露醇模拟的干旱胁迫条件下具有明显的耐受性。该研究对深入了解毛果杨半胱氨酸蛋白酶家族在木本植物中的表达与功能特性具有重要的意义,同时也为进一步揭示木本植物中的半胱氨酸蛋白酶家族在植物生长发育过程中的分子机制奠定了基础。

关 键 词： 毛果杨 实时定量 半胱氨酸蛋白酶 原核表达 转基因

分 类 号： [Q946]

领　　域： [生物学]