中文会议： 中国畜牧兽医学会动物检疫学分会2010年学术年会论文集

会议日期： 2010-08-10

会议地点： 乌鲁木齐

主办单位： 中国畜牧兽医学会

作　　者： ; ; ; ;

机构地区： 中国检验检疫科学研究院

出　　处： 《中国畜牧兽医学会动物检疫学分会2010年学术年会》

摘　　要： 目的我国面临的南非Ⅱ型口蹄疫潜在入侵形势非常严峻。为了防止本病跨境传入，迫切需要建立特异的血清学检测方法.方法以SAT Ⅱ型口蹄疫病毒结构蛋白氨基酸序列为依据，软件分析了FMDV结构蛋白VP1-VP3上可能的抗原表位，并人工合成了8条表位多肽。合成肽通过小鼠免疫试验和ELISA检测方法，分析其抗原性;将筛选出的抗原性良好的多肤采用柔性LINKER拼接，人工合成相应核苷酸后连入T载体中.将酶切回收的串联基因(VP1～VP3)克隆于表达载体PGEX-6P-1中，获得重组质粒PGEX-VP1～VP3.该质粒转化于感受态BL21(DE3)PLYSS中，经IPTG诱导表达并进行WESTERN-BLOT分析和免疫原性、反应原性检测。以纯化的VP1～VP3作为包被抗原，分别优化抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度，确定阴性临界值，建立SATⅡ型FMDV特异性间接ELISA检测方法。结果合成的8条多肽均能与SATⅡ型口蹄疫病毒阳性血清结合，其中的6条多肽免疫小鼠后能产生针对多肽的抗体;串联多肽构建的重组质粒PGEX-VP1-VP3的PCR和测序结果表明，VP2～VP3串联基因已成功插入PGEX-6P-1载体中;PGEX—VP1-VP3融合蛋白分子量约为38.3KDA，并以包涵体形式存在;WSSTERN BLOT结果显示，该融合蛋白能与南非Ⅱ型FMDV阳性血清发生特异性反应;纯化后蛋白进行间接ELISA鉴定结果表明，表达的VP1～VP3蛋白具有良好的反应原性。经反复优化，建立的SAT Ⅱ型FMDV特异性间接ELISA检测方法的抗原最佳包被浓度为6.4UG/ML，血清最佳稀释度为1：200，酶标二抗最佳稀释度为1：4000，阴性临界值(OD450)为0.562.ELISA方法的判定标准确定为： 0D450>0.622为阳性，0D450<0.502为阴性，0.502<0D450≤0.622为可疑。特异性试验结果表明，所建立方法与其它血清型口蹄疫间无交叉反应.结论本研究初步建立了南非Ⅱ型口蹄疫间接ELISA检测方法，为我国口岸SAT Ⅱ型FMDV防控提供了新的方法.

分 类 号： [S85 Q94]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [生物学]