导　　师： 张桂权

学科专业： I0102

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 将玉米的转座子系统ac／ds导入水稻基因组中，诱导产生突变体，已经成为构建水稻插入突变体库的主要策略。本研究利用水稻的ac／ds双因子转座系统，筛选ds转座纯合体植株，采用ta[l—pcr的方法扩增ds元件旁侧的水稻基因组序列，分析ds插入位点旁邻序列，研究相应基因功能，并试图探索构建水稻ds插入突变体库更有效的方法。主要结果如下： l、利用8个不同的t-dna(ds)供体与卜dna(ac)纯合体组配的l0个杂交组合，于2004年早季到2005早季连续三个生长季节共筛选到186个ds转座纯合体。采用tail—pcr的方法扩增ds元件旁侧的水稻基因组序列，对其中17条旁邻序列进行了分析，发现ds分布在水稻6条染色体上，其中4个插入基因内部，1个在预测的mrna内。 2、对水稻黄化突变的研究表明，该隐性突变是由ds插入引起的。利用tail—pcr扩增突变体的ds旁邻序列，分析表明该基因位于水稻第¨染色体，此基因由3个外显子和两个内含子组成，两个内含子边界具典型gt……ag结构。ds插入在第一内含子距下游外显子652bp处，由于ds插入造成水稻基因组在该位点有8bp的正向重复序列。以ac纯合体作母本，突变杂合体作父本杂交，筛选回复突变，在f!代检测990株，筛选到50个目的单株，其中14株ds转座后留有印迹。测序比对发现，ds再次转座后，留下6个碱基的印迹，转座印迹在后代能稳定遗传。 3、用rt一pcr检测目的基因的表达。由于ds插入，突变纯合体基因不表达，凝胶电泳检测无对应产物，突变杂合体较野生型信号弱。取野生型植株幼苗期根、叶及成株期根、叶和幼穗的总rna，检测到目的基因仅在叶中表达，表明目的基因在水稻中呈组织特异型表达。序列预测表明目的基因的orf972bp，编码323氨基酸，分子量35kda，等电点10．26。通过蛋白同源搜索发现该蛋白属adp／atp能量转运蛋白，暂把该基因命名为osaat(adp／atptranslocator)，整个多肽链可分为3个重复区段，各约100残基，序列相似性不到15％，但折叠非常类似，各有2个跨膜区段，6个跨膜螺旋形成桶状结构，转运子具有一致的rrr~im(l)氨基酸序列，adp／atp的转运涉及膜蛋白两种构象的转换。经过全基因组筛查，发现水稻中具有rrrmmm(l)基序的adp／atp能量转运基因有3个，分别位于第2、第5、第11染色体，对应的氨基酸多序列比对发现，前两个有严格的adp／atp能量转运蛋白基序rrrmmm，后一个即为本论文所研究的目的基因，其蛋白基序为rrrmml，亮氨酸取代了蛋氨酸。osaat基因在粳稻(日本晴)和籼稻(93-11)间有5个snp差异。 4、叶绿素含量测定表明，突变体叶绿素b含量不足正常植株的四分之一，其总的叶绿素含量约为正常植株的一半左右。突变体的叶绿素荧光动力学参数表明突变体的光合机构可能已遭破坏，psii的潜在活性降低，psii的电子传递能力下降，qa的还原能力降低，导致psii原初光能转化效率降低。叶绿体透射电镜观测表明，野生型的叶绿体中可以观察到完整的双层膜结构，以及内部相互连接的基粒类囊体，淀粉粒明显可见。突变体的叶绿体大小与野生型相似，具双层膜结构，但叶绿体膜已开始降解，基质中淀粉粒少且小或无。从透射电镜观察结果和目的基因的表达情况推测，osaat蛋白可能不在线粒体，有可能在叶绿体，但不排除位于其它质体例如过氧化物体的可能。 5、由于体细胞转座不能稳定遗传，对后代突变筛选意义不大，而体细胞转座又不可避免，能否区别体细胞转座与配子体转座势必影响ds插入突变筛选的效果。本研究利用ds纯合致死突变，作为新的ds供体，与ac纯合体(作母本)杂交，构建ac／ds双因子转座系统，解决了体细胞转座带来的问题。不仅使ds转座检测工作量减少一半左右，而且区分体细胞转座与ds转座检测工作可同时完成，避免了体细胞转座后代的田间用地和筛选工作。 随着水稻基因组测序计划的全面完成，以序列为基础的水稻ds插入突变将加速功能基因组研究的进程。本文所研究的ds插入黄化突变是典型的光破坏抑制受阻突变体，对其进行研究将会有助于对光合作用机制研究的深入。

关 键 词： 黄化突变体 转运蛋白 突变基因 基因组测序

分 类 号： [S511 Q943.2]

领　　域： [农业科学] [生物学]