导　　师： 周世宁

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 中山大学

摘　　要： 高质量深海沉积物dna提取是进行深海微生物分子生态学研究和宏基因组文库构建的一个重要而且关键的环节。本研究以中国南海东沙群岛北海海域深海沉积物为研究对象，采用玻璃珠裂解法、酶解法、化学裂解法和商品化环境基因组分离试剂盒等方法提取沉积物总dna，用pcr-dgge技术评价不同提取方法对沉积物dna多样性的影响，并在此基础上改进了dna提取方法，提取的dna完整性更好产率更高，并表现出较好的基因组多样性。该方法的建立为本文深海沉积物微生物多样性调查和宏基因组文库的构建奠定了较好的基础。 本研究利用分子生物学技术，以不依赖培养的方式对东沙群岛北海海域深海沉积物的细菌和真菌的群落组成进行了研究。采用细菌16srrna基因通用引物16(+)/1492r构建了3种深度沉积物的细菌16srrna基因文库，并进行扩增rdna限制性酶切片段分析(ardra)，对其中优势条带进行了测序和系统发育分析。结果显示三种深度的细菌16srrna基因序列分布在proteobacteria、cytophaga-flexibacter-bacteroides(cfbs)、planctomycetes、acidobacteria等类群。其中，三个深度沉积物中都是以proteobacteria为优势群落，不同之处在于b深度样品和h深度样品都是以gamma-proteobacteria为优势类群，e样品是alpha-和gamma-proteobacteria占有较大比例。此外，在e和h深度样品中检测到beta-proteobacteria，而b深度样品中没有检测到。planctomycetes类群只在e深度样品中检测到。h深度样品中检测到了acidobacteria和丰富的cfbs类群，在其它两个深度样品中没有检测到。 首次采用真菌间隔区序列(its)对中国南海具备水合甲烷形成条件的深海沉积物真菌群落结构进行了研究，构建5个真菌rrna基因间隔区序列its文库，进行ardra分析和its序列系统发育分析。已测序的25种otu分型的its-rrna序列blast结果显示，最相似序列分别归属于茎点霉属(phoma)，路德酵母属(lodderomyces)，马来西亚属(malassezia)，隐球菌属(cryptococcus)，柱孢属(cylindrocarpon)，hortaea，毕赤氏酵母(pichia)，曲霉属(aspergillus)和假丝酵母(candida)等。系统发育分析表明，25种otu分型可分为三种类型：第一种类型的序列占了全部种类的20％，这类序列主要和一些可培养的种属相关；第二种类型的序列占了全部类型的76％。这部分序列同genbank搜索的最相似序列的相似性都小于94％，但在系统发育树上能较好地聚在一起。大部分序列都归属于酵母分枝；第三种类型只占其中很小一部分，只有4％，这些序列在genbank数据库中没有找到和其最相似序列，在系统发育树上也不能较好聚类。 首次构建pet30表达系统的深海沉积物宏基因组文库。文库克隆平均插入片段为1.2kb，转化效率为2.3×107个/μgdna克隆。结合sds-page分析从pet30a表达文库筛选得到假定rnasehi基因，序列比对显示，该编码序列与来源于alpha-proteobacteria的sulfitobactersp.ee-36具有最高相似性(98％)。该编码序列具有rnasehi酶的保守位点(asp10，glu48，asp70，his124和asp134)，预示假定酶的结构与功能类似于rnasehi。结果证明利用强启动子构建宏基因组文库并结合sds-page电泳分析能够有效筛选出具有蛋白表达的克隆，避免了那些有表达而无活性克隆或表达有活性却不能分泌到胞外的克隆漏筛。 构建了以puc19为克隆载体的深海沉积物宏基因组文库，插入片段平均大小为6.2kb，其中73％的插入片段在4～8kb之间。根据估算，每微克dna得到的克隆为5000～10000个。从文库中随机挑取克隆进行序列分析。分析克隆puc19-14插入序列，结果显示其中的开放阅读框架(orf)编码的是一种跨膜蛋白，该家族蛋白有些与机体耐药性相关，有些与离子或药物分子进出细胞相关，属于机体自卫防卫系统。克隆puc19-35序列分析表明该序列是与莽草酸途径基因簇相关的一段序列。其中两个orf编码的蛋白是假定莽草酸激酶和3-脱氢奎尼酸合成酶，在利用e.coli系统生产奎尼酸和莽草酸的应用中具有利用价值。

关 键 词： 深海沉积物 真菌 间隔区 宏基因组文库 深海微生物 分子生态学

分 类 号： [Q939 Q178.533]

领　　域： [生物学] [生物学] [生物学]