导　　师： 雷建军

学科专业： I0202

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 菜心(brassicacampestrisl．ssp．chinensismakinovar．utilistsenetlee)是广东省栽培面积最大的蔬菜作物。随着生物技术的发展，用生物技术作为辅助手段选育新品种是最近研究的热点和趋势，但菜心是十字花科作物中再生最困难的一种作物，至今尚未建立高效的再生体系和遗传转化体系。本研究以菜心为试验材料，探讨了影响离体再生和遗传转化的一系列因素，初步建立了菜心高效离体再生与遗传转化体系，运用农杆菌介导法将barnase基因成功导入菜心；并对转基因植株进行了鉴定。主要结果如下： l菜心高频离体再生体系的建立 以ms培养基为基本培养基，探讨了不同基因型、外植体类型与生理状态、激素种类与浓度、琼脂和agn03浓度对不定芽再生的影响，利用正交设计试验法探讨了naa、6-ba、agn03和aba等四个因素及其组合对菜心带柄子叶不定芽分化的影响。结果表明：种子升汞消毒8-10min可获得最佳质量的无菌苗；4d苗龄的菜心品种“油青四九”的不定芽分化率最高；不同外植体类型中以带叶柄的子叶分化最好；分化培养基中只添加naa和6-ba，不定芽分化率很低，最高只有14．6％；添加agn03可显著提高不定芽分化率，其中以4mg／l时分化率最高；aba和ga3对菜心不定芽的分化具有一定的促进作用，但是浓度过高，反而会抑制不定芽的分化，在ms+1mg／lnaa+2mg／l6-ba+4mg／lagn03培养基中添加0.1mg／l的aba，不定芽分化率可提高至52.0％，添加0．5mg／l的ga3时，不定芽分化频率提高至55．9％。在ms+1mg／lnaa+2mg／l6-ba+4mg／lagn03+0．2mg／lga3培养基中，琼脂浓度为0.8％时，不定芽分化频率最高，达到61.0％；正交设计结果表明对菜心不定芽分化的最佳组合是：ms+0．6mg／lnaa+6mg／l6-ba+4mg／lagn03+0．25mg／laba，不定芽分化率达到75.0％。 不定芽在培养基ms+0.1mg／liaa+0.2mg／lnaa上的生根率达到82.8％：再生植株移栽基质以泥炭土最好，植株成活率达81.0％。 2菜心高效转化体系的建立 菜心对km和ppt非常敏感，结果表明5mg／l的km就几乎能完全抑制不定芽的再生；ppt6．5mg／l时，不定芽分化率仅为8．6％，超过此浓度，不定芽很难分化，且外植体易黄化。故本试验选用km5mg~或者ppt6．5mg／l作为选择压。 将分化出不定芽的外植体接种至不同浓度ppt的分化培养基中，发现ppt浓度为2．0mg／l时，绝大部分不定芽仍能够保持浓绿色，生长良好；当ppt浓度超过6．5mg／l时，大部分不定芽会逐渐黄化死亡，少数不定芽保持绿色。低浓度(100-200mg／l)的cef或者cb对菜心不定芽发生影响不大，但是浓度达到500mg／l会显著抑制不定芽的分化。cb浓度为200mg／l时，农杆菌增殖受到严重抑制，几乎无农杆菌生长，故抑制农杆菌增殖的适宜cb浓度为200mg／l。 外植体预培养2d，浸入用ms液体培养基悬浮至od600=0．3-0．6的农杆菌液中侵染10min，无菌滤纸吸去残留菌液后，～重新接入分化培养基中暗培养2d，转接至km5mg／l或者ppt6．5mg／l和cb200mg／l的抑菌筛选培养基上对获得的不定芽进行多代筛选，获得了具km或者ppt抗性的绿色芽。抗性芽经过生根培养，炼苗移栽，获得26株抗性植株。 3转基因植株的鉴定 提取抗性芽或抗性植株的dna，进行pcr扩增。检测的45个抗性芽中有10个扩增出目的带，阳性率为22．2％；检测的26株抗性植株中，有8株扩增出目的带，阳性率为30．8％，转化率大约为0．2％。初步表明ta29-barnase基因已经导入菜心中。同时转基因植株移栽至大田恢复正常生长后，能正常开花，花器官外观结构与对照无明显差异，只是转基因植株开的花，雌蕊(柱头)明显高于雄蕊(花药)，而非转化植株的花，柱头和花药几乎平齐，甚至柱头低于花药，也有的花朵，柱头稍微高于花药。转基因植株花粉明显少于非转化植株。花粉生活力检测结果表明，转基因植株的花粉没有活力，不能萌发；而对照花粉发芽率达90％以上。转基因植株不能正常结籽。

关 键 词： 菜心 启动子 基因 离体再生 遗传转化

分 类 号： [Q949.783.5 S636]

领　　域： [生物学] [农业科学] [农业科学]