导　　师： 伏小平;骆学农

学科专业： I0602

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 甘肃农业大学

摘　　要： 单核细胞增生性李氏杆菌(listeriamonocytogenes，lmo)是李氏杆菌属的重要成员，作为一种重要的人畜共患和食源性疾病的病原菌在公共卫生学上有重要意义，如何找到一种快速、敏感特异、合理的检测方法，是各国卫生部门目前亟待解决的问题之一。 lmo的致病性与多种毒力因子有关，但lmo溶血素o(listeriolysino，简称llo)是该菌侵染力的重要组成成分，也是lmo的主要毒力因子，它存在于所有的致病性lmo中。llo是一种能结合胆固醇，可被巯基活化的细胞溶解素，由hlya基因编码。 本研究首先采用生化反应、溶血实验、致病力实验等常规方法对从疑似lmo患病羊脑组织分离的病原作了初步鉴定。随后，分析比较genbank上登录的李氏杆菌hlya基因序列，设计特异性引物，应用pcr扩增lmohlya基因长度为722bp的高度保守片段，对分离菌进行进一步确诊。在此基础上，建立pcr检测方法，此方法的检测极限为104cfu/ml，并且具有良好的稳定性；用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、链球菌检测该方法的特异性，只有lmo能扩增出目的片断，干扰试验的检测极限仍能达到104cfu/ml。该方法对于检测食品中的lmo具有很好的使用价值。 利用pcr技术扩增lmo的hlya基因，将扩增产物与pmd18-t载体连接，重组质粒经酶切鉴定、pcr分析以及确证性测序后证明，所克隆的1594bp的片段含溶血素o蛋白基因1512bp的完整开放性阅读框，编码504个氨基酸，其核苷酸序列和氨基酸序列与国外发表(f5782)的llo蛋白基因的同源性为100﹪。将由重组质粒pmd18-t-hlya上克隆的不含信号肽序列的目的片断和表达载体pgex-4t-1分别酶切后，亚克隆至原核表达载体pgex-4t-1中，通过酶切鉴定及pcr扩增筛选阳性克隆，用iptg诱导表达，收集菌液进行elisa检测、sds-page电泳、western-blot分析，结果表明，hlya基因在大肠杆菌中成功表达，其表达产物(gst-llo)为分子量86kd的融合蛋白，并能被lmo阳性血清所识别，以此为包被抗原的间接elisa可以将lmo阴、阳性血清区分开；猪红细胞溶血实验证明融合蛋白具有较强的裂解真核细胞膜的作用，一定剂量的腹腔注射能将小鼠致死，表明表达产物gst-llo具有生物活性。这为进一步单抗研制和疫苗设计、研究其致病与免疫机理、建立间接elisa诊断方法提供了条件。

关 键 词： 绵羊 分离株 食源性疾病 病原菌 单核细胞增生性李氏杆菌 原核表达 生物学活性

分 类 号： [S858.26 S852.61]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学]