导　　师： 姜子德;庄楚雄

学科专业： I0401

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 香蕉枯萎病是近年来对广东省香蕉生产构成极大威胁的一种土传性维管束病害。本研究根据致病性测定结果和病原菌在komada改良培养基上菌落形态对广东香蕉枯萎病菌的生理小种进行再鉴定。通过应用根癌农杆菌介导真菌转化技术，成功地建立了根癌农杆菌介导的香蕉枯萎病菌4号生理小种转化体系。通过不同接种方法、不同接种孢子浓度等试验，建立了致病突变体的筛选体系。在构建香蕉枯萎病菌4号生理小种基因组cosmid文库的基础上，对致病突变体865和b1233进行了深入研究，获得致病相关基因的基因序列(包括外显子和内含子)；并通过3’．race和5'-race方法得到基因编码区edna全长。 本研究结果表明： (1)在对香蕉组培苗致病性测定的基础上，结合分离菌株在komada改良培养基上菌落形态特征可用来准确快速鉴定香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种，并明确了广东省的确存在香蕉枯萎病菌l号和4号两个生理小种。 (2)影响转化效率的主要因子为乙酰丁香酮(as)的浓度以及共培养时间。预诱导培养时培养基中乙酰丁香酮(as)的有或无对转化效率影响不明显，但在共培养时乙酰丁香酮(as)却是必需的，并随as浓度的增加，转化效率也不断提高，其最佳的as浓度是200p,mol／l；共培养时间越长，转化效率越高，其最合适的共培养时间为48小时。 (3)建立的香蕉枯萎病菌4号生理小种致病突变体筛选体系为：选用4-5叶香蕉组培苗、接种孢子浓度为1×10s个／ml、浸根接种30min、25—32℃下灭菌土盆栽15天后，再根据叶面症状和假茎变色的分级标准来判别发病与否。 (4)通过对近8000个香蕉枯萎病菌4号生理小种转化子的致病性测定，筛选到7个致病突变体，分别为792、820、865、2440、b235、b567和b1233；突变体菌株的营养生长和产孢数量观察表明，突变体2440产孢量少，突变体865菌落平铺、菌落呈不规则型，其他突变体与野生型菌株的基本一致。 (5)所构建的香蕉枯萎病菌4号生理小种基因组文库经质量鉴定后证明，文库插入片段的大小平均在30-40kb之间，文库滴度达到31000cfu／ml，共计有15500个单克隆，包含456-608mb的dna片段，以镰刀菌的基因组为20-40mb计，本文库已经覆盖了香蕉枯萎病菌全基因组的至少lo倍，达到了cosmid文库的质量要求。 (6)由突变体b1233分离到的致病相关基因被命名为foabcl，包含3802个核苷酸，同源性分析表明，该基因编码的蛋白与abc转运蛋白【abc(atp-bindingcassette)transporter]有较高的同源性，同源性的百分比分别为43％-48％，其中与稻瘟病菌的abc转运蛋白相似性最高，达到48％；在线软件对该蛋白进行疏水区和跨膜区的结构预测，结果显示foabcl基因有¨个跨膜区；保守结构预测结果显示有3个完整的保守结构，其中2个是abc跨膜结构，1个是abc-atpase结构，这是典型的abc转运蛋白所共有的保守结构，因此可推测~oabci编码一类abc转运蛋白，在香蕉枯萎病菌的致病过程中起重要的作用，其功能可能同稻瘟病菌的abc转运蛋白一样，负责真菌毒素的泵出，或是像其它真菌的abc转运蛋白，在病原菌侵染寄主植物时能忍耐植物因防卫反应所释放的植保素或抗毒素类物质；不论何种可能，该基因编码的蛋白在真菌致病过程中的作用是不言而喻的。 (7)由突变体865分离到的致病相关基因被命名为fopl，包含5内含子和6外显子，外显子与内含子交接处的边界序列完全遵循“gt／ag”规则；该基因编码蛋白质含331个氨基酸残基，经在线软件进行疏水区和跨膜区的结构预测，结果显示有6个跨膜区；同源性分析结果表明，该基因编码的蛋白与gibberellazeae的一个未知蛋白的相似性高达87％，没有发现保守的蛋白结构；rt-pcr结果表明fopl基因在野生型菌株中正常表达而在突变体865中没有表达，从而进一步证实了fopl基因被打断是造成突变体865致病性减弱的原因。

关 键 词： 香蕉 枯萎病菌 致病基因 转化体系 基因序列

分 类 号： [S668.1 S436.67]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学]