导　　师： 周国辉

学科专业： I0401

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 甘蔗花叶病毒(sugarcanemosaicvirus，scmv)引起的甘蔗花叶病毒病是一种重要的世界性甘蔗病害，其为害严重影响甘蔗的商品价值。培育抗性品种是防治甘蔗花叶病毒病害最经济有效的根本方法，抗病毒基因工程为抗病毒育种提供了广阔前景。本研究探索应用基于rna沉默的转基因策略进行甘蔗的抗病毒转基因研究，构建了scmvcp基因3’端406bp保守片段序列的正向重复克隆，将该序列亚克隆于带有草甘膦抗性基因aroaml2的植物表达载体pgral300，导入农杆菌ehal05中，用工程菌感染甘蔗胚性愈伤组织，经抗性培养基筛选再生小苗，获得了在瓶苗培养阶段具有草甘膦抗性的转基因植株。 在胚性愈伤组织的诱导及甘蔗植株的再生过程中，采用甘蔗幼叶切片为外植体，接种到愈伤诱导培养基(ms+2,4-d2．0mg/l+蔗糖30g/l+卡拉胶10g/l，ph5．8)，诱导胚性愈伤组织的生成；将培养约20d的胚性愈伤组织，转移至愈伤分化培养基(ms+6-balmg/l+kt0．5mg/l+蔗糖30g/l+卡拉胶log/l，ph5．8)，进行小苗的诱导分化；分化的小苗长至高约5cm，转移至生根培养基(1／2ms+iaalmg/l+蔗糖20g/l+卡拉胶10g/l，ph5．8)，诱导根系的生成；将具有发达根系的幼苗经2-3d的“炼苗”后，移栽到温室中。由此，建立了一套完整的甘蔗愈伤组织再生体系。 在转化体系中，采用超毒农杆菌菌株ehal05，克服了植物材料对农杆菌的不敏感性；以接种后约20d的胚性愈伤组织为受体，首先预培养3-4d，随后共培养2-3d直接转入分化培养基进行胚状体诱导出芽，以减少转基因嵌合体的产生；使用aroaml2基因作选择标记，用0．08mmol／l草甘膦作为筛选压对转化体实施持续筛选，以减少假阳性转基因苗的产生；用1501amol／l乙酰丁香酮(as)预处理诱导农杆菌vir基因的表达，以促进t-dna转移。该转化体系简便高效，整个转化过程仅需40d天左右。 对于抗病毒基因的构建，本研究选取scmvcp基因的高度保守区段，通过引物设计在pcr扩增产物的两侧引入合适的酶切位点，扩增产物经酶切和连接操作，电泳分离后纯化，将连接产物克隆于t-载体，成功地获得了长度为812bp的scmvcp基因片段正向重复序列克隆。这一方法简便易行，但在构建反向重复序列时却发生了意外，获得的序列为正向重复，其具体原因尚不明确。 本研究对转化的甘蔗胚性愈伤组织，经草甘膦的抗性筛选，共获得了8个株系的抗性再生幼苗，对尚在瓶苗扩繁阶段的4个转化株系进行pcr分子检测，初步断定获得了转基因的阳性植株，为运用转基因技术进行甘蔗品种的遗传改良打下了良好的基础。

关 键 词： 甘蔗花叶病毒 基因沉默 正向重复 转基因植物

分 类 号： [S435.661 Q943.2]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [生物学]