导　　师： 陈维信

学科专业： I0201

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 蔗糖磷酸合成酶(sucrosephosphatesynthase，sps)是调节蔗糖合成的关键酶之一，与果实发育、碳水化合物运输、品质形成及成熟衰老有着密切关系。香蕉是典型的具有呼吸跃变的热带水果，采后伴随着乙烯的产生和呼吸跃变的出现，果实的淀粉明显向糖转化，最后成熟软化以至腐烂。目前有关香蕉果实后熟过程中sps的研究国内外报道较少。本文研究内容分为两部分，第一部分研究不同后熟条件下，sps与香蕉果实呼吸速率、乙烯释放、硬度变化以及糖积累的关系，sps与其它蔗糖代谢相关酶类的内在联系；研究采收饱满度对香蕉果实sps酶活性和贮藏品质的影响。第二部分研究spscdna片段的克隆及不同后熟条件和不同成熟阶段香蕉果实sps基因表达水平的变化，以探讨香蕉果实sps的作用机理及其基因表达与成熟衰老的规律，为控制香蕉的成熟和提高香蕉果实的贮藏品质提供科学依据。主要的研究结果如下： 采后香蕉果实sps活性变化与乙烯释放和呼吸速率有密切关系。与自然成熟果实(对照)相比，使用乙烯吸收剂不但极显著的延迟了乙烯高峰和呼吸高峰的出现(p＜0.01)，而且抑制了sps活性；而丙烯处理在极显著促进了果实乙烯释放和呼吸速率(p＜0.01)的同时，也大大提高了sps活性，使sps活性高峰比对照提前9天出现。对照、抑制和促进成熟的果实，其sps活性高峰都出现在乙烯高峰和呼吸高峰之前，表明sps可能对呼吸和乙烯起着上游调控作用。 采后香蕉果实sps活性变化与果实软化、淀粉降解和蔗糖形成有密切关系。香蕉果实后熟过程中，果实硬度和淀粉含量随着贮藏时间的延长不断下降，蔗糖含量则逐渐增加，至高峰后下降；乙烯吸收剂明显延缓这些变化的发生，而丙烯处理则加速这些变化的发生。对照、抑制和催熟处理的果实，其sps活性高峰分别比蔗糖积累高峰提前10天、32天和0天出现，即sps活性的高峰发生在蔗糖积累高峰之前或者同时发生，表明sps活性的提高对于果实蔗糖积累发挥着重要作用。在香蕉果实整个后熟阶段，多聚半乳糖醛酸酶活性(pg)和淀粉酶(amylase)活性水平显著低于sps活性(p＜0.01)，而且sps活性高峰出现在pg活性和amylase活性高峰之前，表明sps在果实软化、淀粉降解中占有非常重要的地位。 sps活性与果实糖的积累及其它与蔗糖代谢相关酶之间关系密切。采后香蕉果实的蔗糖积累呈现由低到高再降低的变化趋势，使用乙烯吸收剂或丙烯分别显著延缓和促进果实糖的积累。对照、抑制和促进三种处理的果实，其蔗糖积累量都大大高于果糖和葡萄糖的积累，蔗糖积累占可溶性总糖的50％左右，表明蔗糖是构成香蕉果实糖份的主要因子。在饱和底物条件下的sps酶活性与限制底物条件下(加入无机磷酸pi)的sps酶活性变化趋势一致，但在限制底物条件下sps活性水平较低(p＜0.05)，但不同的底物条件对sps活性高峰出现的时间没有显著影响。蔗糖合成酶的两种方向(合成方向ss-s和分解方向ss-c)都呈现下降的趋势，但ss-s活性范围明显低于ss-c(分别在6-15mmo1.h-1g-1(fw)和15-40mmo1.h-1g-1(fw)之间)，说明在香蕉果实后熟中，ss-c比ss-s起的作用更大。两种转化酶(酸性转化酶ai和中性转化酶ni)均呈现峰形变化的趋势，但ni的变化幅度更小且活性水平更低，表明ai在蔗糖的分解中的贡献更大。对于三种处理的香蕉果实，其sps活性范围都显著高于蔗糖合成酶(ss)和转化酶(inv)，表明sps在采后香蕉果实糖代谢中起着关键的作用。 采收饱满度对采后香蕉果实的成熟衰老具有显著影响。在自然成熟条件下，在贮藏的同一时间，采收饱满度低的果实(6成)比饱满度高的果实(8成)具有较高的硬度和淀粉含量、较低的sps活性、蔗糖含量、病情指数和细胞膜透性，两者间差异显著(p＜0.01)；但在促进成熟条件下，低饱满度的果实(6成)和高饱满度(8成)的果实各种成熟衰老相关性状间无显著差异(p＜0.05)。不同采收饱满度的香蕉果实其蔗糖代谢相关酶的变化有差异，在自然成熟条件下，高采收饱满度(8成)的果实具有更高的sps、ai和ss-c活性，而低饱满度的果实(6成)具有更高的ni和ss-s活性；催熟处理后，两种采收饱满度的果实其与糖代谢相关的各种酶活性之间差异不显著(p＜0.05)。 对sps基因进行克隆是进一步从分子水平研究sps作用机理和调控机制的前提。目前还未见有香蕉果实全长sps基因序列的报道。我们采用rt-pcr的方法克隆得到了大小约1075bp的香蕉果实spscdna片段，与已报道的sps部分基因序列高度同源(98％)，其推导的氨基酸序列与柑橘sps1和番茄的同源性分别为78％和75％。获得高质量的rna是进行基因表达水平分析的关键。香蕉果实中富含多糖及酚类物质，经摸索后本实验采用改良的ctab和licl沉淀法提取了不同处理、不同成熟阶段的香蕉果实的总rna，检测od260/od280接近2，说明提取的rna的完整性较好，适合做进一步实验。 为了能深入研究采后香蕉果实sps基因的功能及作用机制，本试验采用实时定量pcr(real-timequantitativepcr，rq-pcr)的方法对sps基因的mrna做了定量分析研究。发现不同处理的果实其sps基因表达水平和表达规律有明显差异。对照果实和促进成熟果实，采后sps的表达水平都呈现由低到高再降低的单峰变化趋势，促进成熟果实其sps表达高峰出现在第4天，比对照果实提前了11天；抑制成熟果实的sps基因表达则出现两次高峰，分别出现在第20天和第50天。 香蕉果实采后spsmrna的积累水平与sps酶活性间存在密切的关系。自然成熟果实其sps酶活性和基因表达都从12天开始急剧升高，于15天和20天分别达到sps酶活性和基因表达高峰，随后迅速下降；抑制成熟果实其sps酶活性和基因表达高峰完全吻合，分别在第18天和50天出现两次高峰；而促进成熟的果实其sps基因表达高峰比酶活性高峰提前2天出现，说明sps基因的表达调控着sps活性的变化。 采后香蕉果实sps的基因表达与果实的成熟衰老有着不可分割的联系。对照果实在其sps基因表达水平快速提高以后，果实开始软化，呼吸速率和乙烯释放量开始升高。抑制成熟的果实，其sps基因表达水平出现高峰后，呼吸速率开始升高，果实开始软化，乙烯释放量伴随着第二次sps基因表达高峰的出现而增加；促进成熟的果实其sps基因表达开始快速升高的同时，果实快速软化，在sps基因表达高峰过后，呼吸速率和乙烯释放量都达到高峰。三种处理的果实其sps基因表达的增加都出现在果实软化、呼吸速率和乙烯释放量上升之前或同时发生，说明sps基因表达水平的提高是促使果实成熟衰老的重要前提条件之一。

关 键 词： 蔗糖磷酸合成酶 香蕉果实 成熟衰老 糖代谢 基因表达

分 类 号： [S668.1]

领　　域： [农业科学] [农业科学]