导　　师： 李冰

学科专业： G1010

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 广州医学院

摘　　要： 目的：在研究葡萄胎发病机制的过程中，发现了一系列葡萄胎组织高表达的基因，其中f10是一个未知功能的新基因。在前期工作中判断f10与滋养细胞肿瘤及腺癌相关，但在肿瘤发生发展中的意义未知，为此，我们对其进行了初步探索：1.观察f10在组织中的分布；2.f10在细胞内的定位；3.了解f10表达产物对细胞内重要信号转导通路的影响。期望通过以上分析，了解该基因的生物学功能，以及在肿瘤形成中可能的作用。 方法：1.f10基因克隆和序列分析提取葡萄胎组织rna，以之为模板通过rt-pcr扩增出f10的完整编码序列，将其连接至pmd18-t载体，酶切鉴定后测序，并对序列进行生物信息学分析。在此基础上，构建f10的真核表达载体prc/cmv2-f10(包括正向和反向真核表达载体)和原核表达载体pet-gst/f10。 2.f10的组织分布利用原位杂交和免疫组化方法在转录和蛋白水平研究基因表达的组织特异性。以prc/cmv2-f10(-)质粒为模板体外转录制备地高辛标记的mrna探针用于原位杂交实验。pet-gst/f10质粒转化大肠杆菌，在iptg诱导下表达f10蛋白，亲和层析纯化蛋白，纯化的蛋白免疫动物制备多克隆抗体，用于免疫组化的方法分析f10蛋白在多种器官和组织的表达水平。 3.f10基因的细胞内定位和对重要信号通路的影响构建f10与pegfp的真核融合表达载体pegfp/f10，将pegfp/f10瞬时转染人乳腺癌细胞mcf-7后观察f10在活细胞中的定位。将prc/cmv2-f10(+)、prc/cmv2-f10(-)、prc/cmv2与报道系统-3-ap1-luc、nfkb-luc瞬时共转染16hbe细胞，测定萤火虫荧光素酶活性，利用萤火虫荧光素酶报道系统分析f10对细胞重要信号通路的作用。 结果：1.成功扩增f10完整编码序列，总长度为980bp，与pmd18-t载体连接后酶切，结果符合预期设计，并且有正、反连接的pmd18-t/f10载体。经测序后的f10序列网上提交，登陆号是ab196290。将f10序列与genebank上提供的核酸序列相比较，所获得的高度同源基因均为假想基因，或者基因组序列的一部分，功能不明。此外，成功构建了f10的真核和原核表达重组质粒。 2.以prc/cmv2-f10(-)质粒为模板体外转录获得f10基因的mrna探针，探针标记效率可以达到原位杂交要求。原核表达的gst-f10融合蛋白分子量正确，并以his-tag抗体进行westernblot验证表达序列正确；以纯化的f10/gst融合蛋白免疫新西兰大白兔，获得的抗血清elisa检测抗体效价达1：20000，westernblot分析灵敏度至少达20ng。原位杂交和免疫组化发现f10基因在食道、结肠、胰腺、神经节卫星细胞、子宫颈、子宫等正常组织和结肠腺癌、食道、子宫鳞癌等癌组织中均呈阳性表达，免疫组化还发现f10蛋白在子宫颈和食道粘膜的复层扁平上皮细胞以及肠道的单层柱状上皮细胞中的分布存在极性。 3.酶切和测序结果证实成功构建了pegfp/f10的融合表达载体，将pegfp/f10瞬时转染mcf-7细胞，在荧光显微镜下观察可见f10主要分布在细胞质中，呈现非均匀分布，与内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的特异性荧光染料有重叠，以内质网重叠的范围最为明显。也有小量细胞中f10作用在细胞核，或者核浆均有分布。利用萤火虫荧光素酶报道系统ap1-luc、nfkb-luc分析f10在细胞增殖分化中的作用，可见在转染f1024h后的细胞中，luc活性较转染了反义f10及空载体的细胞显著下降，但后两者无显著性差异；而在转染后36h和48h，三者luc活性均下降，无显著性差异。 结论：1.f10蛋白是在多种组织普遍表达的细胞内蛋白，并在肿瘤组织中有增强表达的-4-趋势。其中在复层扁平上皮、神经节卫星细胞、胰腺以及消化道黏膜表达最为强烈；在正常的消化道和子宫颈粘膜中f10蛋白分布出现极性，说明f10不是一种肿瘤特异性基因，更可能与细胞分泌、代谢或者极性相关。 2.f10主要分布在细胞质中，可能与内质网、高尔基体、线粒体等细胞器有关，且f10下调ap1-luc、nfkb-luc的萤火虫荧光素酶活性，这二者表明f10在肿瘤形成过程中与细胞增殖无关，而是很可能与细胞的代谢活动或者分泌有关。 所以，综上所述，f10基因可能是一个与细胞分泌、代谢或是细胞极性形成相关的基因。为下一步的研究提供了方向。

关 键 词： 基因 基因表达 亚细胞定位 信号转导 葡萄胎

分 类 号： [Q786]

领　　域： [生物学]