导　　师： 郭振飞

学科专业： G1001

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 以小麦为材料，对小麦幼苗草酸氧化酶(oxo)进行了纯化，探讨了oxo的酶学性质和化学修饰；分析了不同光照强度对苗期oxo活性的影响和成熟期oxo活性的变化和测定了苗期、成熟期的相关生理生化指标；从小麦dna中扩增gf-2．8，在大肠杆菌、酵母中表达gf-2．8，并制备了检测萌发素的western杂交用的第一抗体；通过农杆菌介导法用gf-2．8转化烟草、拟南芥，得到pcr和卡那霉素检测的阳性植株。本文旨在建立高效简便的小麦oxo纯化方法、了解oxo催化反应机理、oxo在萌发后的幼苗期和成熟期的生理功能与调节机理，为进一步研究oxo的生物学功能及h202在信号传递中的作用奠定基础，为建立具有自主知识产权的oxo商业应用提供技术贮备。 通过酸热变性、超滤浓缩、sephadexg．100凝胶过滤、concanavalina亲和层析四个步骤得到了电泳纯小麦幼苗oxo部分纯化制剂，纯化倍数为66．¨倍，回收率21．93％，sds-page测定oxo亚基分子量为32．6kd。 等电聚焦测定oxo的pi为7．6，高于预测值(预测值为6．34)；凝胶过滤法测定全酶分子量为172kd；0．6mmol／l的草酸抑制oxo的活性，km=0．2072mmol／l；oxo的最适ph为3．5；化学修饰法表明，含游离羧基的氨基酸和lys可能为酶的必需基团，cys只是起到维持酶正常构象的作用，但化学修饰法不能证明his为酶的必需氨基酸。 测定了小麦萌发后苗期不同光照条件下oxo活性、sod活性、pod活性、cat活性、乙醇酸氧化酶活性、草酸含量和h202含量变化，并以gf-2．8为探针对总rna杂交，结果表明，低光照强度下oxo活性高于较高光照强度下oxo活性，低光照能够促进oxomrna的表达，oxo为小麦幼苗产生h202的主要来源，低光照条件下，pod的活性较低，cat无明显变化，推测h202积累的原因是由于oxo活性上升与pod活性下降造成的，而不是cat活性水平的降低。 测定了小麦成熟期花结构中的外桴、内桴及浆片的oxo活性变化及相关生理生化指标，外桴、内桴及浆片中oxo活性在扬花后第35天达到最大值，活性水平与苗期低光照的维管转换区相近，h202含量高于苗期，而pod活性低于苗期，木质素在扬花后第10-45天呈上升趋势，提示h202的积累是由于oxo分解草酸和较低活性水平的pod使其分解减缓，同时，较低活性水平的pod能够维持木质素的合成。成熟期由于花结构中蛋白质含量明显低于苗期，而oxo活性水平与苗期相近，成熟期oxo比活性较苗期高。 对fy-2．8进行了在大肠杆菌中原核表达和在酿酒酵母中表达，均检测不到oxo活性，以原核表达产物为抗原制备的第一抗体与不同时期的小麦幼苗的oxo提取液杂交，浸种第4天杂交信号较强，第10天、第12天只能检测到很弱的信号，与oxo活性检测结果一致，说明随生长天数的增加，oxo活性下降的原因是由于oxo的减少，northern杂交也表明，随培养天数的增加，mrna的表达量下降。 通过转基因操作，得到pcr检测和含卡那霉素培养基筛选的烟草tl代阳性植株、拟南芥t2代阳性植株。经southern杂交检测，证实已获得转基因植物。

关 键 词： 小麦纯化 化学修饰 光照强度 转基因植物 草酸氧化酶

分 类 号： [S512.1 Q943.2]

领　　域： [农业科学] [生物学]