导　　师： 刘松财

学科专业： G1010

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 吉林大学

摘　　要： 干扰素（Interferon, IFN）是一种细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等生物活性。猪干扰素α1(poIFNα1)具有广谱抗病毒活性，毒副作用小，速效多能。胸腺肽（Thymosin，THY）α1是由28个氨基酸组成的多肽，无明显种属特异性，能够连续诱导T细胞分化、发育和成熟，增强NK细胞功能，提高机体免疫力。医学临床表明，干扰素与胸腺肽具有协调和互补作用，联合应用优于单独使用，具有更强的抗病毒功效。当前，兽医临床缺乏高效廉价的抗病毒生物制剂，干扰素和胸腺肽在兽医临床应用较少，将poIFNα1及THYα1进行融合表达尚未见诸报道，本实验拟利用基因工程方法将二者进行融合表达，以提高其联合抗病毒活性，同时降低生产成本，为猪病毒性疾病的预防和治疗提供新方法。密码子偏爱性是影响外源蛋白在大肠杆菌中表达量的重要因素，因此本研究依据GenBank已发表的poIFNα1成熟肽基因序列，THYα1蛋白序列及大肠杆菌密码子偏爱性，对poIFNα1和THYα1基因序列进行了密码子偏爱性优化并人工合成poIFNα1和THYα1基因。为将poIFNα1及THYα1融合表达，并维持其原有的生物学活性，本实验利用SOE-PCR法在poIFNα1和THYα1之间设计3个不同序列的连接肽：ARG（LinkerA），GGGGSARGGGGGS（LinkerB），GGGGSGGGGSGGGGS（LinkerC），其中ARG为凝血酶的蛋白酶切位点，可使poIFNα1和THYα1在体内被凝血酶切开，GGGGS为柔性较高的短肽，有助于维持融合蛋白原有生物学活性。将构建的三种融合基因及poIFNα1基因分别连接至pRSFDuet-1原核表达载体，鉴定结果表明，成功构建了poIFNα1及三种poIFNα1-THYα1融合基因原核表达载体。将poIFNα1及三种poIFNα1-THYα1融合基因原核表达载体分别转化BL21(DE3)感受态，IPTG诱导表达，超声破碎菌体，经SDS-PAGE和Western blot鉴定表明目的蛋白均存在于菌体裂解液上清中，为菌体内可溶性表达。为优化目的蛋白的诱导表达条件，本实验利用正交试验法设计并进行了9个平行试验，结果表明，温度30℃、IPTG浓度0.5mmol/L、诱导时间12h时目的蛋白表达量最高（P<0.001），灰度分析表明目的蛋白总量约占细菌总蛋白的22.13%。数据分析表明温度、IPTG浓度、诱导时间对于蛋白表达水平的影响程度，依次为诱导时间＞温度＞IPTG浓度。药品质量标准对于蛋白药物的纯度要求严格，为满足工业生产的要求，本实验利用强阴离子交换层析和疏水层析对poIFNα1蛋白及3种poIFNα1-THYα1融合蛋白进行初步纯化，获得了纯度约为90%的目的蛋白。为确定凝血酶酶切位点的有效性，本实验对poIFNα1-LinkerA-THYα1、poIFNα1-LinkerB-THYα1融合蛋白进行了体外酶切实验，SDS-PAGE结果表明融合蛋白在ARG处被成功切开。为测定poIFNα1蛋白及3种poIFNα1-THYα1融合蛋白的生物学活性，本实验利用细胞病变抑制法及T细胞活性测定法分别检测poIFNα1蛋白及3种poIFNα1-THYα1融合蛋白的干扰素活性和3种poIFNα1-THYα1融合蛋白的胸腺肽活性。结果表明，poIFNα1蛋白及三种poIFNα1-THYα1融合蛋白均具有一定的抗病毒活性，三种融合蛋白也具有一定的胸腺肽活性，其中poIFNα1-LinkerB-THYα1融合蛋白具有相对较高的干扰素活性（P<0.001），poIFNα1-LinkerA-THYα1融合蛋白具有相对较高的胸腺肽活性（P<0.05）。本研究对poIFNα1及THYα1的融合表达进行了初步探索，获得了具有一定干扰素活性和胸腺肽活性的纯度较高的融合蛋白，但是其纯度及活性尚不足以达到药品质量标准对纯度及效价的要求，需要进一步优化纯化工艺及提高其生物学活性，并通过体内试验进一步验证融合蛋白的联合抗病毒活性及其他生物学功能，从而为其大规模生产及临床应用奠定前期实验基础。

关 键 词： 猪干扰素 胸腺肽 融合蛋白 活性检测

分 类 号： [S859.79]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学]