导　　师： 刘子铎

学科专业： G1010

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 华中农业大学

摘　　要： 继蛋白酶后,纤维素酶和半纤维素酶广泛应用于工业中。其中,β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)可以水解以甘露糖为主链的半纤维素,彻底水解还需要β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)、β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)和乙酰甘露聚糖酯酶(EC3.1.1.6)的协同作用。p-甘露聚糖酶来源广泛,普遍存在于微生物和动植物中。其应用广泛,在食品加工、咖啡提取、生物乙醇、制药和造纸等领域中都有重要作用。本实验研究的β-甘露聚糖酶(Man26P),是从深海成团泛菌(Pantoea agglomerans)中筛选得到的属于糖苷水解酶第26家族的酶。该基因(GenBank accession no. FJ648764)有1047个碱基,编码348个氨基酸,分子质量大约38.51kDa,对底物槐豆胶的亲和力Km值为5.78mg/mL,催化效率(kcat/Km)为106.65mL/mg-s,最适温度为55℃,最适pH为6.0,在30～70℃、pH4.0～8.0条件下酶学性质良好且稳定。为了获得酶学性状更优良的菌株,并且为了更深入的理解蛋白结构与功能之间的关系,利用无引物PCR中添加200μmol/L Mn2+的DNA shuffling技术和定点突变技术对Man26P进行改造。DNA shuffling文库的筛选结合了刚果红平板显色法和基于96孔板的高通量筛选法。从该突变文库中筛选19,700个克隆子,获得突变子G267S和H134R/F141L。与野生型甘露聚糖酶Man26P相比,G267S和H134R/F141L对底物槐豆胶的Km值分别降低3.78倍和2.77倍,催化效率Man26P分别提高1.14和3.30倍。而后通过定点突变技术,更多的突变氨基酸被引入到第134位点。这其中与(kcat/Km)相比,H134R和H134K对底物槐豆胶的Km值分别降低2.32和1.56倍,催化效率Man26P分别提高2.81和2.75倍。并且发现随着第134位点上突变氨基酸残基侧链pKa值的增大,突变子对底物槐豆胶的Km减小,这可能是因为极性作用和正电荷作用增强导致的。除此,结合分子模拟分析揭示出第267位点上氨基酸残基的性质会影响酶对底物的亲和力和酶释放底物的速度。考虑到突变菌株酶活力的提高和突变氨基酸结构的特点等因素,选择H134K和G267S进一步研究温度和pH对突变子酶活力的影响。结果发现H134K和G267S的最适温度分别是55℃和50℃。与Man26P相比,H134K和G267S在60℃热处理10min后,酶活开始迅速下降,处理30min之后,相对酶活力不足50%,热失活时间大大缩短。H134K和G267S与野生型酶的最适pH相同,pH稳定性相似,在pH4.0～10.0范围下活性稳定。本研究对甘露聚糖酶的定向进化提供了新的依据。

关 键 词： 甘露聚糖酶 改组 定向进化 催化效率

分 类 号： [Q814]

领　　域： [生物学]