导　　师： 王栋

学科专业： G1010

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 中国农业科学院

摘　　要： 目的:以中国仓鼠卵巢（CHO）细胞为宿主，构建高表达抗表皮生长因子受体（EGFR）单克隆抗体的细胞株。方法：本研究通过化学合成方法获得分别编码抗EGFR单克隆抗体轻链和重链的DNA序列，克隆入双启动子表达载体；通过优化的电转方法，瞬时转染确定目的蛋白表达的可行性，再转入悬浮CHO宿主细胞，确定G418的工作浓度，在含G418的化学成分已知的培养基中进行克隆筛选，得到的克隆经MTX加压扩增进一步提高表达产量，最后对加压后的高产细胞进行亚克隆化，获得稳定高表达抗EGFR抗体的细胞株，通过体外癌细胞增殖抑制实验鉴定了所表达抗体的生物学活性。结果：优化的电转染条件为20μg质粒/6×106细胞，方波，231V电压，电击24ms。瞬时转染实验表明所构建的重组表达载体能够在CHO细胞中表达。按250细胞/孔接种96孔板进行克隆筛选时，G418最低致死浓度为1mg/ml。稳定转染后接种40块96孔板，14日后得到483个克隆，全部挑到24孔板中，静置培养7日后，检测表达量，选择表达量在2.0mg/L以上的61个细胞株到T25方瓶中培养，经过5日静置培养后，再次检测表达量，选择了表达量在4.7mg/L以上的15株细胞到50ml摇瓶中，120rpm培养，每3至4日传代一次。这15株细胞中对MTX扩增有反应的细胞株有4株，分别是anti-EGFR-12#、anti-EGFR-228#、anti-EGFR-355#和anti-EGFR-426#。将这4株细胞分别亚克隆后，最后获得6株从表达和生长都相对较好的细胞株，分别是anti-EGFR-12#-24、anti-EGFR-228#-1和38、anti-EGFR-355#-6和40、anti-EGFR-426#-11。最后进行了稳定性分析，构建6个细胞株的细胞库。表达量最高的细胞株anti-EGFR-355#-6在批次培养中最高活细胞密度可达10.2*106细胞/ml，抗体表达产量达704.2mg/L。体外活性分析表明，所表达的抗EGFR抗体对人表皮癌细胞A431的增殖具有明显的抑制作用。本研究为抗EGFR抗体的生产提供了稳定高产的细胞系。

关 键 词： 表皮生长因子受体 单克隆抗体 细胞系

分 类 号： [Q78]

领　　域： [生物学]