导　　师： 段玉玺

学科专业： I0401

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 沈阳农业大学

摘　　要： 大豆胞囊线虫病（Heterodera glycines）是大豆生产的毁灭性病害之一，该病害在世界上分布广泛，每年对全世界的大豆生产造成了巨大的损失。目前，防治大豆胞囊线虫病的方法主要有种植抗病品种。由于基因工程育种具有周期短、效率高、易于种植栽培、抗性持久、具有广谱抗性等优点，因此成为抗病育种中的有效措施之一。重要基因的发现、鉴定及获得是应用基因工程育种和大豆遗传改良的的首要前提。我国作为大豆的起源地，具有着丰富的抗大豆胞囊线虫的品种资源和种质资源库，充分利用和发掘这些资源，扩展抗病基因表达谱，分离和克隆抗线虫基因对于抗大豆胞囊线虫育种和抗线虫机制的研究具有重要意义。本研究以抗大豆胞囊线虫3号生理小种的小粒黑豆（国家种质库编号ZDD1412）为材料，利用抑制消减杂交方法构建cDNA文库，从文库中筛选抗病相关基因并进行序列分析，进而克隆出目的基因。通过研究胞囊线虫侵染后大豆根部早期基因表达谱，探索大豆与胞囊线虫之间的不亲和性互作的基因，初步了解小粒黑豆对大豆胞囊线虫的抗性机制。获得以下结果：1.利用多重PCR诊断大豆胞囊线虫本实验采用两组引物对大豆胞囊线虫进行双重PCR鉴定。第一对是通用引物D3A和D3B，用于扩增线虫核糖体28S基因的D3扩展区，第二对引物中一个是大豆胞囊线虫的特异性扩增引物GlyF1，另一个是通用引物rDNA2，扩增区间为部分的ITS2区和部分28S基因。经凝胶电泳检测PCR扩增出两个明显的DNA片段，大小分别为181bp和345bp。将获得的PCR产物进行测序及BLASTn比对，鉴定结果为扩增片段为大豆胞囊线虫ITS区。2.构建大豆胞囊线虫诱导小粒黑豆的SSH-cDNA文库本研究结合SMARTerTMPCR cDNA合成技术和抑制消减杂交（suppressionsubtractive hybridization，SSH）技术，以接种大豆胞囊线虫3号生理小种二龄幼虫后12h、24h、48h、72h大豆根尖为检测方（Tester），以接种无菌水根尖材料为驱动方（Driver）同时构建Heterodera glycines诱导大豆根部早期表达的正向及反向SSH-cDNA文库，对文库的部分特性进行分析，结果表明文库的滴度为4×108pfu/ml，插入片段大小在200-1000bp之间，文库中重组子的重组率为90%以上，并对该文库中的重组子进行了菌液扩繁和保存。3.从SSH-cDNA文库中筛选阳性克隆及抗病相关基因的测定及生物学功能分析本研究从构建的SSH-cDNA消减文库挑选PCR扩增片段在100bp以上的阳性克隆548个，与经DIG标记的Tester-cDNA和Driver-cDNA探针，进行进一步的杂交筛选，共筛选出362个在接种和未接种线虫的小粒黑豆根部表达或表达量增加的基因。对筛选到的阳性克隆进行测序及序列分析，获得280个表达序列标签（EST），经CAP3软件聚类拼接，得到166个unigene差异表达，在GenBank先后进行Blastn与Blastx同源比对，全部EST与已知蛋白或基因具有不同程度的同源性，已知基因功能的EST涉及信号识别和传导、能量与物质新陈代谢、膜及转运、木质素和类黄酮的生物合成、抗病防御、细胞保护和转录调控，揭示胞囊线虫早期侵染大豆是一个多基因共同参与的复杂过程。本研究在Heterodera glycines侵染小粒黑豆早期发现了表达频率较高的基因如过氧化氢酶、泛肽素、几丁质酶、脂肪氧合酶、水通道蛋白、成熟调控蛋白、金属硫蛋白、脂膜嵌入蛋白、细胞色素P450和3-磷酸甘油醛脱氢酶等，并推测这些基因在早期的大豆与胞囊线虫的非亲和互作过程中起重要作用。4. Real Time PCR检测抗病相关基因的表达本试验根据前期的研究结果，通过SSH-cDNA文库的构建、斑点杂交筛选及BLAST比对分析，从文库中筛选出20个抗病相关的重要基因进行定量检测，成功的设计出15个基因的特异性扩增引物，并对这些基因在接种胞囊线虫后12h、24h、36h、48h、72h进行定量检测，明确这些基因在大豆根部受大豆胞囊线虫侵染后的早期诱导表达情况，包括参与防御反应的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、脂肪氧合酶（LOX）、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、Syringolide-induced protein；生物代谢及合成途径中的异甘草素2’-O-甲基转移酶、苯乙醛还原酶、丝氨酸羟甲基转移酶、肉桂酰CoA还原酶、异黄酮还原酶；信号传导的环指蛋白（Ring-finger protein）；细胞组成成分的组蛋白基因和细胞周期的依赖性细胞周期激酶；运输功能的大豆根瘤素-26（Nod-26）；参与能量代谢的葡糖糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate-dehydrogenase）和MYB62转录因子等基因。编码脂肪氧合酶、苯乙醛还原酶、MYB62及组蛋白的基因呈间歇状上调或下调表达。其它的大部分基因在接种后12-48h呈上调表达，但同时很多基因在72h的表达发生转折。5.大豆谷胱甘肽过氧化物酶的克隆、诱导表达及生物信息学分析在胞囊线虫与大豆不亲和性互作早期差异表达的SSH-cDNA文库中获得了一个编码谷胱甘肽过氧化物酶的EST片段。利用RT-PCR （Reverse Transcription PCR）方法从大豆胞囊线虫（Heterodera glycines）侵染的大豆根部组织中克隆到谷胱甘肽过氧化物酶（GPX，Glutathione peroxidase），命名为GmGPX1。序列分析结果表明，该基因位于大豆基因组5号染色体上，含有6个外显子和5个内含子，扩增cDNA全长693bp，包括7bp的5’非翻译区（UTR）和185bp的3’非翻译区（UTR），开放阅读框长度为501bp，编码166个氨基酸，蛋白质分子量为18375.8Da，理论等电点为6.59。通过氨基酸序列比对分析，该序列与其他物种GPX类蛋白质氨基酸序列有很高的相似性；聚类分析结果表明，GmGPX1与NCBI中预测GPX氨基酸序列（XP₀03532707.1）遗传距离最近，与拟南芥（NP₅64813.1）遗传距离相对较远。实时荧光RT-PCR（Real-time PCR）分析发现GmGPX1的表达水平在接种胞囊线虫后3d的大豆根尖较未接种的样品稳定提高，结果表明GmGPX1受到了线虫侵染的诱导，该基因参与了大豆早期防御胞囊线虫的侵染过程，该基因对解除由线虫的侵染和移动所诱导的氧化损害起了很重要的作用。6.大豆GmHs1pro-1的基因克隆及表达分析通过RT-PCR方法，从小粒黑豆中克隆了目标基因GmHslPro-1的cDNA，全长为1477bp，该基因位于大豆基因组2号染色体上，包括27bp的5’非翻译区（UTR）和135bp的3’非翻译区（UTR），在536bp处有一个poly A结构，ORF长度为1314bp。本研究结果发现在接种3号生理小种12h，该基因在小粒黑豆中的诱导明显上调，其相对表达量是对照的10倍之多。但其表达量在接种后的72h呈间歇状上调或下调，这表明该基因受到了胞囊线虫的诱导表达，并且参与到了与线虫互作的过程中。

关 键 词： 大豆胞囊线虫 大豆 抑制消减杂交 基因差异表达

分 类 号： [S435.651]

领　　域： [农业科学] [农业科学]