导　　师： 赵献军

学科专业： I0603

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 西北农林科技大学

摘　　要： 仔猪腹泻是影响养猪业健康发展的主要疾病之一。尽管导致仔猪发生腹泻的原因非常复杂,但产肠毒性大肠埃希菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)是引起仔猪腹泻的主要病原菌。目前,国内外很多学者对由ETEC引起腹泻的发病机理、诊断和防治进行了大量的研究并取得了很大的进展,但对猪源ETEC在机体肠道内分子水平的增殖研究较为有限。本研究基于SYBR GreenⅠ染料建立检测LT和STa两种肠毒素基因的荧光定量PCR方法,旨在特异、快速地检测猪源ETEC。此外,本研究还通过该法对猪源ETEC在人工感染小鼠肠道内的增殖规律进行研究,为进一步阐明ETEC在体内的致病机制提供实验数据。结果如下:1.常规PCR扩增LT基因的部分序列,获得314 bp的目的片段,对该核酸序列进行克隆,重组质粒经PCR及测序鉴定后,根据测序结果设计一对荧光定量引物,将梯度稀释的重组质粒pMD19-LT作为标准品,建立LT的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线为:Y=-3.33X+42.77,相关系数为0.999,PCR扩增效率为99.7%,其灵敏度为4.09×10~3拷贝/μL,特异性试验结果显示大肠埃希菌C83912(STa+)和ATCC25922为阴性,而C83903(LT+)和重组质粒pMD19-LT为阳性,说明设计的引物对LT具有特异性。重复性试验结果显示批内和批间重复性试验的变异系数均小于3%,说明该方法具有良好的稳定性和重复性。2.根据GeneBank中公布的STa序列(登录号为M25607),选择在其保守区设计引物,PCR可获得323bp的目的片段,对该核酸序列进行克隆,重组质粒经PCR及测序鉴定后,根据测序结果设计一对荧光引物,将梯度稀释的重组质粒pMD19-STa作为标准品,建立STa的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线为:Y=-3.271X+47.902,相关系数为0.999,PCR循环效率为102.2%,其灵敏度达到8.85×10~2拷贝/μL,特异性试验结果显示大肠埃希菌C83903 (LT+)和ATCC25922为阴性,而C83912(STa+)和重组质粒pMD19-STa为阳性,说明STa引物只能扩增STa基因片段。重复性试验结果显示批内变异系数分别为1.08%,0.92%,0.61%,批间变异系数分别为1.22%,1.86%,1.51%,表明该方法具有良好的准确性和重复性。3.用大肠埃希菌C83903 (LT+)和C83912(STa+)感染小鼠建立腹泻模型,收集小肠内容物,利用上述建立的荧光定量方法对其进行检测。检测结果显示:人工感染致病性ETEC(LT+)的小鼠在感染后第4 h、16 h和2 d样品均为阳性,第7 d和第14 d样品为阴性。人工感染致病性ETEC(STa+)的小鼠自感染后第4 h、16 h、2 d、7 d、14 d的样品均为阳性。以上结果表明,肠毒素LT和STa在感染机体肠道组织的增殖存在差异,本研究从分子水平对致仔猪腹泻ETEC的感染致病机制提供进一步的认识。

关 键 词： 产肠毒素大肠埃希菌 肠毒素 荧光定量 重组质粒

分 类 号： [S858.28]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学]