导　　师： 石庆华;黄俊成

学科专业： G1010

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 新疆农业大学

摘　　要： 玻璃化冷冻对卵母细胞的发育潜能造成一定影响,而母源基因的表达不仅影响卵母细胞的生长,又对胚胎的早期发育起决定性作用。本实验通过玻璃化冷冻、BCB染色等方法,运用Real-time PCR技术检测的mRNA在卵母细胞中的表达量,探讨玻璃化冷冻前后的卵母细胞中母源基因的表达水平、BCB鉴定卵母细胞质量的可靠性与分子机理及Gdf9、Mater、Zar1、Dnmt1基因与玻璃化冷冻后卵母细胞质量的相关性。主要研究结果如下：经过BCB染色筛选后,胞质着色的为BCB+的卵母细胞体外成熟率、受精率及囊胚率依次为86.16%、85.29%、34.4%高于胞质未着色的BCB-50.94%、36.19%、6.73%(P<0.01)。这说明BCB对绵羊卵母细胞筛选这一方法的可行性和可靠性。这四种母源基因在BCB+卵母细胞中的表达量要显著低于BCB-(P<0.05),表明这四种母源基因的mRNA表达量可能与卵母细胞的质量呈负相关。对不同成熟时期的卵母细胞经玻璃化冷冻解冻后,继续进行体外培养。研究结果发现,GV期冷冻的卵母细胞的存活率、成熟率和卵裂率分别为45.93%、14.51%、9.67%,极显著低于对照组M24(—、91.11%、82.96%)、实验组M18h+V(68.29%、36.71%、23.21%)和实验组M24h+V(72.44%、48.91%、31.57%)(P<0.01),但M18h与M24h的冷冻效果差异不显著(P>0.05)。而卵母细胞中的母源基因表达量在GV+V最高(P<0.01)；GV期的卵母细胞母源基因的含量低于GV+V,但是高于其他实验组(P<0.01)；而M18h+V的母源基因表达量高于M24h+V(P<0.01)；V+M24h比M24h+V的卵母细胞母源基因含量高(P<0.01)；对照组(M24h未冷冻)的卵母细胞母源基因相对含量最低。这说明越接近成熟24h的绵羊卵母细胞其玻璃化冷冻保存的效果越好,而Gdf9、Mater、Zar1、Dnmt1基因的mRNA表达量与玻璃化冷冻有相关性,可能与卵母细胞质量、体外培养效率呈负相关性。分别将筛选的BCB+卵母细胞体外成熟24h再冷冻解冻(BCB(+)M24h+V),未筛选的卵母细胞体外成熟24h再冷冻解冻(M24h+V),进行体外培养,结果表明：实验组BCB(+)M24h+V的存活率、成熟率、卵裂率为87.85%、64.22%、48.78%,显著高于实验组M24h+V 72.44%、48.91%、31.57%(P<0.05)。实验组BCB(+)M24h+V的母源基因表达量要显著低于实验组M24h+V(P<0.05)。说明BCB染色可应用在玻璃化冷冻技术上,在卵母细胞冷冻前,可先筛选出质量好的卵母细胞,直接淘汰胞质不成熟的卵母细胞,从而减轻冷冻的工作量,提高了解冻后卵母细胞的可用率及胚胎的发育率,此方法可以考虑在今后生产中推广‘应用。

关 键 词： 卵母细胞 母源基因 实时定量 亮甲酚蓝染色液 玻璃化冷冻

分 类 号： [S826]

领　　域： [农业科学] [农业科学]