导　　师： 余林

学科专业： H1704

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 广东工业大学

摘　　要： 葡聚糖(Glucan)是以葡萄糖为单体的聚合物的总称。制糖工艺过程出现的葡聚糖主要为α-葡聚糖,又称右旋糖酐(dextran),是以α-D-葡萄糖为单体、以1-6键连接的直链为主链(约占95%以上)形成的高分子聚合多糖,其分子式为(C6Hio05)n。从蔗汁到精制产品,所有制糖工艺过程自始至终存在葡聚糖所引起的不良的影响。葡聚糖的产生和存在使蔗糖损失,明显增大糖液的粘度,降低糖液的过滤性,影响煮糖、结晶与分蜜,增加制炼成本,并且严重影响糖产品的质量。本论文针对制糖过程存在的α-葡聚糖的降解、检测的难题,构建并筛选了高效表达α-葡聚糖酶的基因工程菌株,并进行发酵试验研究；对发酵所产α-葡聚糖酶在甘蔗制糖过程α-葡聚糖的分解清除和医药领域微分子右旋糖酐的生产中进行相关的应用研究；成功制备了α.葡聚糖特异性单克隆抗体并研制出α-葡聚糖检测试剂盒。主要实验研究工作如下：1、α-葡聚糖酶基因工程菌的构建与筛选通过基因工程方法,构建pPICZ a A-DEX重组质粒,将源自青霉的α-葡聚糖酶基因整合进入毕赤酵母基因组,实现了外源α-葡聚糖酶融合蛋白的表达。所构建的X-33/pPICZaA-DEX毕赤酵母工程菌株,以甲醇为诱导物,其外源基因通过醇氧化酶AOX启动子的调控,得以高效转录表达。在国际上首次构建以三磷酸甘油醛脱氢酶GAP启动子作为外源基因启动子的pGAPZ a A-DEX重组质粒,进而构建KM71H/pGAPZ a A-DEX毕赤酵母工程菌株。该菌株在表达外源蛋白时,外源基因通过GAP启动子的调控,在以甘油或葡萄糖等为碳源的培养基上无需诱导物的存在就可以表达,产酶量和菌体密度具有较强的趋势一致性。2、α-葡聚糖酶基因工程菌的发酵对X-33/pPICZaA-DEX毕赤酵母工程菌株产酶培养基进行优化,探讨了温度、溶氧、初始pH、接种量、诱导阶段甲醇浓度和补料间隔时间等对产酶的影响。5L发酵罐流加培养甲醇诱导型工程菌株产酶,在优化的发酵工艺参数条件下,α-葡聚糖酶的活力最高可达1048 U/mL,国内领先,并通过了广东省科技厅组织的技术鉴定；5L发酵罐流加培养KM71 H/pGAPZaA-DEX产酶,在优化的发酵工艺参数条件下,α-葡聚糖酶的活力最高可达398 U/mL。以上两种不同类型的工程菌各有特点,探索完善其相关的发酵工艺,可为大规模工业生产α-葡聚糖酶打下基础。3、α-葡聚糖特异性单克隆抗体的制备及其检测试剂盒的研制以Dextran T-40-BSA交联物免疫小鼠,用常规方法进行细胞融合,间接ELISA方法筛选阳性克隆,同时采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的亚克隆和培养,成功建立了7株杂交瘤细胞株,其效价均大于106；经纯化的抗体其重链分子量为50000,轻链分子量为23000；与BSA、OVA,蔗糖,葡萄糖等无任何交叉反应,证明抗体的特异性。运用获得的单克隆抗体建立α-葡聚糖定量检测免疫比浊法,在国内首次成功研制α-葡聚糖定量检测试剂盒,于2010年7月通过国家质检总局验收并获高度评价,国际先进,解决了α-葡聚糖(右旋糖酐)快速、准确、便捷检测的难题。α-葡聚糖定量检测免疫比浊法有望成为国家标准方法乃至国际统一分析法。4、α-葡聚糖酶的酶学性质及其稳定性研究研究了α-葡聚糖酶的酶学性质,表明α-葡聚糖酶的最适反应温度为45-50℃,最适反应pH=4.5-5.0；酶的储存稳定性较好,pH=4.5-5.0时葡聚糖酶较稳定,4℃保存,半衰期约为35天。采用葡萄糖作保护剂研究了其对α-葡聚糖酶的稳定性影响,表明葡萄糖可以极大地减少酶活的损失；以蔗糖作为保护剂,在室温下酶活基本没有损失。5、α-葡聚糖酶在制糖过程中的应用研究在实验室研究中,以降粘率、除色率、葡聚糖去除率等指标为判断依据综合评价α-葡聚糖酶对蔗汁澄清的效果,通过实验确定α-葡聚糖酶的各种使用条件。2009/2010榨季在广东省台山市海宴华侨农场糖厂进行模拟生产工艺试验,在不同清净工艺中对蔗汁的澄清效果试验表明,α-葡聚糖酶对甘蔗制糖过程蔗汁的清净有较大的帮助,对提高澄清汁的纯度尤为明显；α-葡聚糖酶处理低纯度蔗汁后其葡聚糖含量和色值都有较大的下降,表明葡聚糖酶对低纯度蔗汁的效果相当明显。6、α-葡聚糖酶在合成微分子右旋糖酐中的应用研究创新性地提出肠膜明串珠菌发酵蔗糖产微分子右旋糖酐新工艺,在发酵过程中应用α-葡聚糖酶进行催化水解协同作用,通过控制α-葡聚糖酶的添加量和添加时间控制右旋糖酐的分子量,一步法直接发酵生产微分子右旋糖酐。培养基中13%的蔗糖在24小时内转化率达90%以上,在发酵16小时时添加0.8-1.2 U/mLα-葡聚糖酶,可一步合成分子量为3000-8000Da的右旋糖酐；用超滤膜截留发酵液,可分离提纯得到符合《中华人民共和国药典》要求的右旋糖酐。新工艺解决了传统工艺中右旋糖酐分子量无法控制、酸水解废水污染大以及分离纯化有机溶剂用量大等问题。

关 键 词： 葡聚糖 右旋糖酐 制糖 葡聚糖酶 毕赤酵母 发酵 单克隆抗体

分 类 号： [TQ925]

领　　域： [轻工技术与工程] [化学工程]