导　　师： 柏志全;王立伟;陈丽新

学科专业： G1003

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 暨南大学

摘　　要： 目的：克隆人细胞周期蛋白D1基因,构建真核表达载体,诱导并鉴定其表达后,探讨细胞周期蛋白D1对氯通道C1C-3的影响作用及其分子机制。方法：利用RT-PCR法,以低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞mRNA为模板,扩增周期蛋白D1基因,构建重组表达载体pIRES2-EGFP-D1和pEGFP-C2-D1,脂质体介导重组质粒转染CNE-2Z细胞,免疫荧光、Western blot等鉴定其表达；利用荧光共振能量转移技术(FRET)分析细胞周期蛋白D1和氯通道C1C-3之间的相互作用；利用膜片钳技术测定高表达周期蛋白D1细胞的容积激活性氯电流,微电极细胞内透析CDK6抗体及应用CDK4／6阻断剂后,观察细胞氯电流变化。结果：电泳获得918bp预期片段,重组质粒经酶切、PCR和测序分析证实含有周期蛋白D1完整读码框,将重组质粒导入CNE-2Z细胞并成功表达,目的蛋白经免疫荧光和Western blot鉴定具有生物学活性；细胞周期蛋白D1和氯通道CIC-3之间发生了荧光共振能量转移(FRET)现象,说明两者距离小于10nm,具有相互作用；高表达周期蛋白D1的细胞,其容积激活性氯电流增大；胞内透析CDK6抗体后,容积激活性氯电流减小；1nM CDK4／6抑制剂可激活氯电流且不能被低渗增大,随着抑制剂浓度增高,激活的氯电流减小且低渗能增大该电流。结论：成功克隆并构建含周期蛋白D1基因的真核表达GFP质粒；细胞周期蛋白D1通过CDK4／6磷酸化修饰CIC-3氯通道从而影响其功能,CDK4磷酸化氯通道使其关闭,而CDK6磷酸化氯通道使其开放。

关 键 词： 细胞周期 细胞周期蛋白 细胞周期蛋白依赖性激酶 容积激活性氯通道 氯通道 膜片钳 荧光共振能量转移

分 类 号： [Q25]

领　　域： [生物学]