导　　师： 徐海滨

学科专业： I05

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 中国疾病预防控制中心

摘　　要： 目的利用我国本土驯化和培育的实验用近交系五指山小型猪作为模式动物,(1)通过在其体内同时安置胃肠瘘管的方法定时同步收集胃肠消化液,建立在体消化稳定性动物模型,以大豆、花生作为阳性对照,评价转CpTI基因水稻和转人乳铁蛋白(LF)牛奶的在体消化稳定性,旨在建立适用于评价转基因食品潜在致敏性的大动物在体消化稳定性模型；(2)采用大豆抗原球蛋白和β-伴球蛋白作为阳性致敏物,采用不用佐剂的经口致敏途径建立大豆蛋白诱发五指山小型猪食物致敏经口模型；结合佐剂,采用腹膜致敏和经口激发结合的模式建立大豆蛋白诱发五指山小型猪食物致敏的经腹膜模型,目的在于建立适用于评价转基因食品潜在致敏性的大动物模型；为我国建立转基因食品致敏性的评价程序和实验方法提供一定理论和实验依据。方法1五指山小型猪在体消化模型的建立及其初步应用在成年(22～30kg)雄性五指山小型猪体内通过手术同时安置胃肠瘘管,其中肠瘘安置在回肠远端,胃瘘安置在胃大弯处,术后14天稳定后,进行在体消化稳定性试验。正式采样时所有小型猪均控制在0.5～1min内进食完毕以保证采样时间的一致性。试验前禁食16h,试验当天给样前先采集空白胃肠消化液,经口喂饲受试物(250mL纯净水混合100g大豆粉、花生粉、米粉或250mL对照牛奶或LF牛奶)后,选择11个胃液点和6个肠液点,分别经胃瘘管和肠瘘管收集Oh,0.25h,0.5h,0.75h,1h,2h,3h,4h,5h,6h点胃液1.5-2.0mL和0h,1h,2h,3h,4h,5h,6h点肠液0.5～1.5mL,测量pH值,离心取上清,考马斯亮兰法定量蛋白,调整每孔蛋白上样量≤10μg,进行蛋白凝胶电泳,比较大豆、花生、米粉和牛奶给样后不同时点受试物蛋白在胃液和肠液中的消化稳定性。制备了抗重组大豆β-伴球蛋白β亚基单克隆抗体,并经三次克隆化筛选和亲和纯化后与冀nf327大豆胃肠消化产物进行Western-Blot免疫印迹,确认大豆β-伴球蛋白p亚基在胃肠内的消化和迁移状况。2五指山小型猪食物致敏模型的建立及其机制研究2.1经口诱发五指山小型猪大豆蛋白过敏反应的实验研究20头(5窝×4头)五指山小型猪仔猪45d完全断乳,适应4d后进入实验。按区组(窝别)随机设计分至5组,每组4头,分别为对照组,4% 11S,8%11S,4%7S和8%7S致敏组。仔猪在进入实验后每周称重一次,观察并记录试验全期各组仔猪的活动和腹泻情况。进入实验当天为第0天,第0～10d(致敏期)和16～18d(激发期)分别进食将纯化大豆抗原11S和7S蛋白按每日总饲料量的4%或8%比例均匀拌入的无大豆配方饲料,对照组喂饲无大豆配方饲料；各组仔猪在实验第11d和19d分别中期采血一次,第25d进行皮肤试敏试验；第32d末次激发进行终期采血、麻醉、放血处死和解剖取材。血清总IgG、IgE抗体、组胺、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10细胞因子和肠组织组胺含量均采用ELISA试剂盒分析；外周血淋巴细胞亚群(CD3/CD4/CD8)的表达在统一分离PBMC后集中上流式细胞仪分析；肠组织粘膜和粘膜下层肥大细胞经甲苯胺蓝特殊染色后在网型目镜测微尺下计数分析。2.2经腹膜诱发五指山小型猪大豆蛋白过敏反应的实验研究将来自4窝共8头仔猪按区组(窝别)随机分至2组,每组4头,分别为霍乱毒素对照组(i.p. 100μg霍乱毒素)和β-伴球蛋白致敏组(i.p.500μgβ-伴球蛋白+100μg霍乱毒素)。妊娠母猪分娩前2周开始逐步换食无大豆配方饲料,生产分娩为实验第0天,第15,16,17天经腹膜致敏,第25天腹膜加强致敏,第45天断乳出栏,第47天第一次经口激发,第54天皮肤试敏试验,第61天第二次经口激发,终期解剖。五次采血时间分别为：(Ⅰ)第15天第一次腹膜致敏前；(Ⅱ)第25天第四次腹膜致敏后；(Ⅲ)第35天第五次腹膜致敏后；(Ⅳ)第49天第一次经口激发后；(V)第61天第二次经口激发后。每次采血前称重,观察并记录试验全期各组仔猪的活动和腹泻情况；皮试和血清总IgG、IgE抗体和组胺含量测定、外周血淋巴细胞亚群分析以及肥大细胞计数同2.1；采用间接ELISA方法测定β-伴球蛋白特异性sIgG水平；采用血球计数仪上分析外周血嗜酸和嗜碱性粒细胞比例；分离PBMC采用MTT法集中进行外周血淋巴细胞的转化和增殖功能分析,培养上清Th1/Th2细胞因子(IL-2, IFN-γ, IL-4)采用ELISA试剂盒检测。结果1五指山小型猪在体消化模型的建立及其初步应用小型猪术后胃瘘普遍可保持较长时间(数月～14月),而肠瘘相对较易脱落(数天～数月)；禁食16h后空白点胃液pH值为1.5～2,受试物给样后pH值迅速上升,在4～6h后pH值又开始下降；花生、大豆给样后胃液pH值下降均较缓,在给样后5h左右pH值降到低至2；米粉给样后0.25～0.5h胃液pH降低到2,牛奶给样后2～3h胃液pH降低到2；根据与分子量标准的比较,大豆给样后胃液中0～1h保持的蛋白片段有40kD,0～2h为150kD/80kD/71 kD/67kD/20kD,0～3h为15kD,0～6h为50kD/34kD/17kD/13kD;肠液中4～6h保持的蛋白片段为50kD/34kD/20kD/17kD,其中胃液中3h后逐步减少的34kD、20kD大豆蛋白亚基片段在4h后出现在肠液中,而50kD、20kD、17kD蛋白亚基片段在肠液中呈高丰度表达；花生给样后胃液中0～0.75h保持的蛋白片断有48.5kD,0～1h保持的蛋白片段有58Kd/17.9Kd/15kD,0～2h为63kD/39kD,0～3h为23.5kD,0～6h为12kD；肠液中2～6h保持的蛋白片段为23.5kD。胃液中3h后消失的23.5kD花生蛋白亚基片段在1h后即出现在肠液中并持续到6h；抗重组β-伴球蛋白β亚基单抗除能识别β-伴球蛋白β亚基(50kD),还能识别分子量为34kD左右的大豆蛋白亚基；征对大豆蛋白中50kD和34kD两个亚基的单抗对大豆在体消化产物的印迹结果为：胃液中50kD亚基持续存在到给样后6h,34kD亚基持续存在到给样后2h,与SDS-PAGE电泳结果相似,其中给样后0h胃液点还可看到28kD条带显现；肠液中0～2h未见任何条带,3h开始隐现50kD亚基条带,4～6h肠液中该条带清晰可见。米粉给样0.25h后胃液中未检出任何耐受蛋白酶消化的片段,而亲本明恢86米粉和转CpTI基因米粉比较,无论是胃液或肠液中蛋白消化情况均无明显区别；对照牛奶和LF牛奶给样后胃液中消化蛋白情况均较米粉复杂,蛋白消化条带较多,但比较对照牛奶和LF牛奶在人LF蛋白分子量位点未见明显差异。2五指山小型猪食物致敏模型的建立及其机制研究2.1经口诱发五指山小型猪大豆蛋白过敏反应的实验研究2头4% 11S和2头4% 7S蛋白致敏仔猪自经口致敏第2天开始相继出现轻度腹泻症状,持续2～4 d；接受大豆11S和7S蛋白致敏仔猪皮肤在相应蛋白皮试点呈不同程度的阳性红斑反应,但均较组胺注射点反应轻,而未接受大豆蛋白致敏的仔猪皮肤试敏试验基本呈阴性反应；第19d 4%11S和4% 7S致敏组血清中IgG、IgE抗体和组胺含量均高于对照组,第32d 4%11S和4%7S致敏组IgE抗体和4%11S致敏组IgG抗体和组胺含量均高于对照组；三个时间点仔猪血清中IgG、IgE抗体和组胺含量两两呈正相关,均在第19d即激发期后达到最高；4%7S致敏组空肠组胺高于对照组,4%11S致敏组空肠粘膜下层肥大细胞数目低于对照组,空肠组胺含量与十二指肠组胺、回肠组胺含量呈正相关,而与空肠粘膜层和粘膜下层肥大细胞数呈负相关；第19d 4%7S致敏组血清中IFN-y含量较对照组较低,而8%11 S致敏组CD4+/CD8+比值较对照组升高。2.2经腹膜诱发五指山小型猪大豆蛋白过敏反应的实验研究7S蛋白致敏组2头动物在第4次腹膜致敏后出现腹泻,持续3天后缓解；霍乱毒素佐剂对照组4头动物7S注射点红斑反应均为阴性,而7S蛋白致敏组2头动物7S注射点红斑反应为阳性；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、V时间点7S蛋白致敏组血清中β-伴球蛋白特异性IgG水平均高于霍乱毒素佐剂对照组；与霍乱毒素佐剂对照组比较,第一次经口激发后7S蛋白致敏组CD4+/CD8+比值升高,1000μg/ml 7S刺激下的淋巴细胞增殖能力明显升高。结论1首次在五指山小型猪体内通过手术安置胃肠瘘管,建立了转基因致敏性评价的小型猪在体胃肠消化液同步分析模型；该模型应用于不同食物致敏原(花生、大豆)的在体消化稳定性分析,并通过SDS-PAGE蛋白凝胶电泳对胃肠在体消化产物进行了初步鉴定。2通过本研究首次制备的大豆β-伴球蛋白β亚基单抗对大豆消化蛋白进行了免疫印迹确认,建立了五指山小型猪在体消化模型消化蛋白的确认方法。3首次将五指山小型猪在体消化模型应用于转CpTI基因水稻和转人乳铁蛋白(LF)克隆牛牛奶致敏性的评价,初步证明明恢86水稻和转CpTI基因水稻,对照牛奶和转LF克隆牛牛奶在五指山小型猪体内消化稳定性属实质等同。4证明经口和经腹膜致敏五指山小型猪均为食物潜在致敏性评价的可用动物模型,评价指标可选择腹泻、皮肤试敏、血清特异性和总IgG和IgE抗体含量、血清组胺水平、肠道肥大细胞数目、外周血淋巴细胞亚群和淋巴细胞转化增殖功能等,综合目标蛋白的特点和可获得使用量等情况选择适宜的致敏途径。5大豆抗原球蛋白和β-伴球蛋白可经口诱发五指山小型猪产生IgE介导的I型超敏反应,机理可能与CD4+/CD8+比例失调、肠道肥大细胞增殖活化脱颗粒导致组胺释放增加有关；大豆抗原蛋白经口诱发食物过敏不一定呈剂量反应关系。6在佐剂辅佐作用下,大豆抗原β-伴球蛋白可经腹膜诱发五指山小型猪产生IgE介导的I型过敏反应,机理可能与CD4+/CD8+比例失调和T淋巴细胞增殖活跃有关；血清sIgG较总IgG和IgE更能反映β-伴球蛋白经腹膜致敏的特异性,且该指标有一定累积效应,在多次腹膜加强致敏和经口激发后达到峰值。

关 键 词： 食物过敏 五指山小型猪 转 基因水稻 转 克隆牛牛奶 转基因食品大豆球蛋白 大豆 伴球蛋白 伴球蛋白 亚基 大豆 花生 在体消化稳定性 动物模型

分 类 号： [S828]

领　　域： [农业科学] [农业科学]