导　　师： 张兆旺

学科专业： I0501

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 甘肃农业大学

摘　　要： PCR技术为胚胎的性别鉴定提供了新的手段。利用PCR进行胚胎的性别鉴定具有快速、灵敏、准确和易操作等诸多优点,是各种胚胎性别鉴定技术中最有前景的一项技术。本实验以提高鉴定的灵敏度、减少鉴定时间及建立胚胎性别鉴定的可操作程序为指导进行实验的设计,分别做了以下探讨,并取得了预期的结果:1.利用牛性别决定基因(SRY)作为雄性特异性基因和酪蛋白αs1基因(CSN1S1)作为内标基因分别设计雄性特异性引物和内标引物,两对引物均各设计一对嵌套式引物进行多重PCR,并同时对外引物组合和内引物组合进行体系的优化,以便用于牛早期胚胎性别鉴定。SRY基因和CSN1S1基因外、内引物扩增片断长度分别为357bp、232bp、528bp和367bp。实验结果表明,这两个引物组合建立的扩增体系均有较高的扩增稳定性和准确率,但它们的灵敏度均不高(约50pg,相当于16个细胞的DNA量),这在一定程度上限制了其在胚胎性别鉴定中的应用。2.由于SRY基因和CSN1S1基因建立的多重巢式PCR体系的灵敏度无法满足胚胎性别鉴定的要求,故在以上优化体系为基础的基础上,建立巢式PCR体系,以提高扩增的灵敏度。经反复实验,该体系的灵敏度可达到一个细胞的DNA量,完全可以用于牛早期胚胎的性别鉴定。3.由于SRY基因为单拷贝基因,当胚胎性别鉴定时,所采得细胞数很少时,体系中SRY基因的相对量就较少,这大大的限制了其灵敏度。故在选择Y染色体上的一段重复序列作为雄性特异性引物,以肿瘤坏死因子(TNFα)为内标引物建立多重PCR,进行牛早期胚胎性别鉴定。共设计四对引物—Y染色体重复序列外引物和内引物其大小分别为534bp和480bp,肿瘤坏死因子外引物和内引物大小分别为357bp和272bp。试验结果表明,优化后的多重PCR体系的灵敏度可达到三个细胞,可以满足胚胎性别鉴定的需要。4.虽然Y染色体重复序列和肿瘤坏死因子(TNFα)基因建立的多重PCR体系的灵敏度较高,但在细胞数较少时,电泳条带很弱,且较不稳定。故建立多重巢式PCR。如上所述,其灵敏度也可达到一个细胞,且稳定性很好。

关 键 词： 牛 胚胎 性别鉴定 基因 染色体重复序列

分 类 号： [S823]

领　　域： [农业科学] [农业科学]