导　　师： 黄东阳

学科专业： G1010

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 汕头大学

摘　　要： 维甲酸类物质是脊椎动物体内重要的生理活性物质，通过调节基因的转录参与形态发生、细胞生长、细胞分化、免疫功能调节等生理过程；在抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化、凋亡以及抗感染等病理过程中也具有广泛的生物学效用。细胞内维甲酸类物质的平衡受饮食、体内相关代谢酶类等多因素的影响，但是相关酶类调控维甲酸类物质代谢的机制到现在仍然没有完全阐明。辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢／还原酶（NADP（H）-dependent retinol dehydrogenase／reductase，NRDR）是黄东阳教授等于1997年从兔肝中发现并纯化的一种能催化视黄醇和视黄醛之间氧化脱氢过程的酶，体外实验显示该酶对视黄醛有很高的底物特异性和亲和性。视黄醇和视黄醛之间的转化反应是体内维甲酸合成的限速步骤，因此NRDR对体内维甲酸类物质的平衡可能起着调节作用，其功能性表达将有助于对其进行系统性研究。本研究采用Gateway基因克隆和蛋白表达系统（Invitrogen）对NRDR进行表达。首先从兔肝中克隆NRDR全长序列，将其编码区构建至pDEST^TM 17上，再转化到BL21-AI工程菌中表达出兔NRDR蛋白并鉴定其表达形式；取工程菌裂解上清通过一步金属离子亲和层析纯化得到该蛋白。取纯化蛋白以反相高效液相色谱法（HPLC）测定该酶的Km和Vmax值。最后以纯化蛋白免疫豚鼠，获得豚鼠抗兔NRDR多克隆抗体，以Western-Blot法分析抗体特异性。本研究最终获得了可溶性的NRDR蛋白，而且具备较高的视黄醛还原活性。经过分析，确认诱导表达4小时后目的蛋白的表达量最高，可占总蛋白量的41.4％；通过一步金属离子亲和层析可以得到纯度为97.2％的兔NRDR，而比活性提高了64倍；进一步对该酶进行活性分析，HPLC测得该酶对视黄醛的Km值为（4.55±0.33）μmol，V_max为（0.307±0.065）μmol／（min·mg），活性与兔肝中的纯化蛋白相近。将获得的多克隆抗体应用于Western-Blot中检测兔NRDR效果良好，为NRDR的进一步研究打下基础。

关 键 词： 辅酶 依赖性视黄醇脱氢 还原酶 维甲酸类代谢 表达 纯化 多抗制备

分 类 号： [Q78]

领　　域： [生物学]