导　　师： 李恩民;李伍举

学科专业： G1010

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 汕头大学

摘　　要： 对甲醇营养型毕赤酵母表达系统的研究和应用有近20年的历史。大量文献资料表明，许多外源基因可以在毕赤酵母中成功表达，但表达水平有时相差很大。基因表达的影响因素较多。迄今为止，人们尚不能在实验前对目的基因的表达水平进行有效评估。在本文中，我们分析了外源基因3’末端二级结构与表达水平之间的关系；在此基础上，建立了一个针对pPIC9表达载体在毕赤酵母中高效表达的数学模型。而且以NGAL(Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin)为目的基因，应用这一模型对NGAL基因是否能在毕赤酵母中高效表达进行了预测和实验验证，初步证明了这一数学模型的准确性。 内容与方法： 1．收集了40例应用pPIC9载体在毕赤酵母GS115株中表达目的基因的数据。获取下列基本信息：基因名称、表达量、目的基因插入载体的酶切位点、基因扩增引物等，拟定以表达量100mg／L为界限，按此界限将40例目的基因表达水平分为高／低两组。 2．从NCBI获取相关目的基因的核酸序列，与基因的3’端扩增引物进行核酸序列比对，确认表达载体的翻译终止密码子前后各100bp的序列，据此对每个数据构建200bp的片段。 3．从上述每个基因的200bp片段，截取9，000个区间，截取方式为[X，Y]，X和Y在200bp片段的范围为1≤X≤100，和111≤Y≤200。 4．使用RNAfold软件计算每个区间最低自由能，构建最低自由能矩阵。 5．使用Tclass分类程序和目的基因的分类信息对最低自由能矩阵进行t检验及判别分析，得到理论上可以判别表达水平高低的区间组合，随后重复200次按75％比例随机将所有40例目的基因的自由能数据分为训练集和检验集，通过分类稳定性分析来筛选最佳判别区间组合。 6．利用获得的最佳判别区间组合建立判别函数，将40个数据按75％比例随机分成两组，并利用多数组建立判别函数，此过程重复1000次，最终得到1000个判别函数。 7．构建NGAL基因的200bp片段，利用RNAfold软件计算上述步骤“6”结果中最佳判别区间的最低自由能。

关 键 词： 二级结构 载体 毕赤酵母 蛋白表达

分 类 号： [Q786]

领　　域： [生物学]