导　　师： 罗泽民;金志强

学科专业： G1001

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 湖南农业大学

摘　　要： 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是一种重要的热带经济林木，其胶乳是目前工业用天然橡胶的唯一来源，由于具有特殊而重要的用途，在热带地区被广泛种植。提高胶乳产量一直是橡胶栽培及生产的主要目标。自从1968年乙烯利被首次作为化学刺激剂而应用于提高胶乳产量以来，不仅胶乳增产效果明显，而且创造了一整套以乙烯利为刺激手段的刺激割胶新制度，带来了显著的经济效益。但是，由于乙烯利应用的普及，乙烯利刺激割胶引起橡胶树发生死皮病及加速胶树衰老，缩短胶树寿命等副作用也越来越明显。为了克服这些副作用，使乙烯利能更有效地刺激增产，长期以来，人们在细胞水平、膜水平和乳管细胞内含物的生理生化层面上进行了大量的研究，但仍未完全了解乙烯对胶树的作用机制。本研究从分子水平入手，克隆橡胶树的乙烯受体基因(etr1)，并在转录水平和蛋白质翻译水平上研究etr1基因在乳管细胞中的表达及与乙烯刺激的关系，取得了以下结果： 1．通过对GenBank登录的已克隆的植物etr1基因序列进行核苷酸同源性分析，设计特异引物。以胶乳总RNA为模板，反转录成cDNA第一链，又以cDNA第一链为模板进行PCR扩增，得到特异扩增片段。 2．把扩增得到的特异片段连接到pGEM-T Easy载体上，用Cohn法转化大肠杆菌DH5α，经过筛选、鉴定，得到阳性克隆子。 3．从阳性克隆子中提取克隆片段，经序列测定分析，结果表明，克隆片段的cDNA大小为816bp，编码的蛋白质包含272个氨基酸。基因序列通过Blast 2.0 Network Service软件对GenBank，EMBL，DDBJ，PDB四个大型数据库中记录的1 337 978条核酸和蛋白质序列进行序列相似性检索，结果表明与芒果、 一 西番莲、波斯梅、草毒、葡萄、西洋梨等15种已报道的植物的etrl基因cDNAg 的同源率为75％～88％；蛋白质氨基酸序列的同源率为90％～95％，表明本研究 确实克隆到了橡胶树 e tri基因的 cDNA序列。 4．从橡胶树 PR107品系的嫩叶提取基因组 DNA，用限制性内切酶 EcoR、Hinofll 分别酶切，琼脂糖凝胶电泳分离并转膜后，用克隆的橡胶树 e tri基因的 cDNA 片段作探针进行 Southern杂交分析，结果表明，EcoR酶切在约 3．okb处有 一条杂交带出现，HI。ofll酶切在约4．skb处有一条杂交带出现。对cDNA进行 酶切位点分析，该 cDNA内部不含 ECOR和 Hinofll酶切位点，表明 e tri基因 在橡胶树基因组中只有1个拷贝，为低拷贝基因。 5．用橡胶树PR107、RRIM600、GTI三个品系的基因组洲A分别经HinAn酶切后， 进行了Southern杂交。结果表明，三个无性系都只出现一条杂交带，位置一’致（～4．skb人说明etr基因在这三个品系的橡胶树中并无遗传背景上的差异。。6．用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）技术，对橡胶树 e tr基因在转录水平一 一”””—”—一”一”—一 一’”－’””——””－——————’””’”’ （mRNA水平）上进行基因表达量的差异分析。结果表明，上述三个橡胶树品系 对照和乙烯处理共六个样品都得到了特异扩增条带。各胶乳样品的扩增条带。、在亮度上有明显差别。用 Scion Ima邵软件分析各泳道中条带的亮度，计算出 对照与各处理的RT－PCR产物相对量。分析结果表明，橡胶树不同品系经乙烯 利刺激处理后，e tri基因的表达量均有明显的增加，增加量随不同品系有所不 同，处理是对照的二．374～4．733倍，说明橡胶树对乙烯利刺激的反应较为敏 感。增加值有可能成为橡胶育种上的早期预测指标。 7．从乙烯处理的橡胶树植株和对照植株胶乳中提取蛋白质，进行SDS－PAGE。结 果表明，电泳图谱含有 30～40个条带，大小在 10～100余 KD之间，强带和 弱带约各占一半。不同品系之间的蛋白电泳图谱差异不大；同一品系乙烯处 理和对照相比，在约 14KD和 18KD处的两个蛋白条带的表达量上有明显增加。 “说明乙烯刺激使某些胶乳蛋白在表达量上发生了变化，这些变化为乙烯刺激’．导致胶乳产量增加奠定了基础。

关 键 词： 巴西橡胶树 乙烯受体基因 分子克隆 表达分析

分 类 号： [Q943]

领　　域： [生物学]