导　　师： 吴锐全;叶星

学科专业： I0801

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 湛江海洋大学

摘　　要： 近年来频繁爆发的虾类病害引起了人们对虾类自身免疫机制的重视。目前普遍认为虾类和其它无脊椎动物一样，体液中不具有免疫球蛋白，缺乏脊椎动物所具有的特异性免疫机制，主要依靠体内的非特异性免疫因子抵抗外来病原的入侵。溶菌酶是生物体内重要的非特异免疫因子之一，在引发和维持机体防御免疫的过程中起重要作用。本实验克隆了罗氏沼虾（macrobrachium rosenbergii）、日本沼虾(macrobrachium nipponense)溶菌酶基因cdna，并以重组罗氏沼虾溶菌酶lyz-t质粒作为模板，pcr法制备罗氏沼虾溶菌酶基因的生物素标记探针，用northern dot blot方法检测罗氏沼虾正常和弧菌感染个体各组织中的溶菌酶基因的表达情况，初步评价其免疫防御功能，为进一步开展虾类的免疫防御分子机制的研究奠定基础。 1 两种沼虾溶菌酶基因orf的克隆与序列分析 　本实验参考多种生物类群的溶菌酶基因序列，设计并合成引物。分别提取罗氏沼虾和日本沼虾血细胞总rna。以此总rna为模板，rt-pcr扩增获得特异性cdna片段，纯化后克隆到t载体上。重组子序列测定表明，所克隆的2种沼虾溶菌酶基因的开放阅读框（orf）均为477bp，编码158个氨基酸，包括成熟肽140个氨基酸残基和信号肽18个氨基酸残基。同源性分析表明，所克隆的2种沼虾溶菌酶的基因序列和推测氨基酸序列之间都具有较高同源性，分别为99.4％和98.1％；与已在genbank上登录的对虾溶菌酶基因的同源性为80％以上。与人、鸡、鱼、按蚊等不同生物类群的c-型溶菌酶的推测氨基酸序列同源性也高于30％。2种沼虾溶菌酶都具有c-型溶菌酶保守的两个酶活性位点谷氨酸残基（glu51）和天门冬氨酸残基（asp68），以及保守的8个半胱氨酸残基（cys），因而推测所克隆的2种沼虾溶菌酶基因属c-型溶菌酶基因。同时，由于所克隆的2种沼虾溶菌酶缺少c-型溶菌酶的钙结合亚型所特有的3 个保守的天门冬氨酸残基（asp），可认为这两种沼虾溶菌酶基因属于c-型溶菌酶的非钙结合亚型。 2 罗氏沼虾溶菌酶基因的组织表达分析 2．1 罗氏沼虾溶菌酶基因正常个体的组织分布 用pcr法制备了生物素标记的内参照18s rrna基因探针和溶菌酶基因探针，并利用此探针与各组织总rna样品进行斑点杂交，结果显示罗氏沼虾溶菌酶基因在眼、肌肉、鳃、肝胰腺、血细胞、肠管等组织中均有表达，但表达量不同。其中在肠管中的表达量最高，肝胰腺次之，肌肉中的表达量最低。 2．2 罗氏沼虾溶菌酶基因在感染个体不同组织中的表达 斑点杂交检测受弧菌感染的罗氏沼虾个体溶菌酶基因在各组织中的表达，结果表明受感染后6h,在虾的眼、肌肉、鳃、肝胰腺、肠管等组织中溶菌酶基因的表达量均有升高，其中以肝胰腺中的表达量最高，约为对照组的5.6倍。在血细胞中的表达量稍有降低。 2．3 罗氏沼虾溶菌酶基因在肝胰腺中的表达随感染时间的变化 在不同的感染时间里，肝胰腺中溶菌酶基因表达量有较大的变化：感染后3h表达量最低，6h后迅速升高，表达量约为对照组的4倍。24h后表达量升至最高，大约为对照组的4.3倍，48h时的表达量有所下降，但仍明显高于对照组（约为3.3倍）。 小结：上述溶菌酶基因组织表达分析表明溶菌酶是罗氏沼虾重要的免疫防御因子，在病原入侵后起重要防御作用。溶菌酶基因在所检测的罗氏沼虾各组织中均有分布。受感染6h后多个组织的表达量升高，以肝胰腺的表达量最高。不同感染时间里，肝胰腺中溶菌酶基因的表达量有较大的变化，说明肝胰腺作为重要的消化器官同时也具有免疫防御功能。

关 键 词： 罗氏沼虾 日本沼虾 溶菌酶 基因克隆 序列分析 生物素探针 斑点杂交

分 类 号： [S945.41]

领　　域： [农业科学] [农业科学]