导　　师： 廖明;辛朝安

学科专业： I0602

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 本文从山东地区疑似鸭肝炎病料中分离得到4株病毒，经血清中和试验、动物回归试验、电镜观察、dot-elisa鉴定、核酸类型和生物学特性研究进一步证实为1型鸭病毒性肝炎病毒(dhv)，分别命名为scl03、sjh04、sjh06和syn06。将这些山东分离毒株与广东、江苏、河南等地的分离株(gfs00、jyz02、hzz04)及标准疫苗株av2111在不同宿主中的适应性比较后，发现所有毒株均适于在适龄鸭胚中生长，多数毒株经盲传后可以适应鸡胚生长。多数dhv毒株对鸭胚肝细胞(del)的适应性强于鸭胚成纤维细胞(def)和鸭胚肾细胞(dek)，而scl03株对def的适应性强于其它宿主，8毒株均不能适应鸡胚源细胞和veto细胞。 本文对鸭病毒性肝炎的人工发病方法进行了优化，选取致病性最强的毒株sjh06为代表，分析了试验鸭感染病毒后机体的病理组织学变化及血清生化指标的动态变化。结果显示，雏鸭感染dhv后肝、脾、肺、肾等器官出现明显的病理变化，胰、心、脑、肌肉、肠等器官也表现不同程度的损伤。雏鸭感染后丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、谷氨酰胺转移酶和胆碱酯酶的含量显著升高(p≤0.01)，表明肝胆功能损伤严重；乳酸脱氢酶较对照组明显升高(p≤0.01)，表明心肌受到损伤；严重的低尿酸血症表明肾小管受到损伤；α-淀粉酶活性、血糖浓度较对照组明显降低，而血脂显著升高；总蛋白、白蛋白和球蛋白在整个试验期间表现为先升高后降低的趋势。 本文完成了8株dhv全基因组测序，发现各毒株的基因组长度有所不同(7707nt-7713nt)，但结构分区基本一致，包括626nt的5'非编码区、6747nt的开放阅读框(627nt-7376nt)和314nt的3'非编码区及17nt-23nt的poly(a)尾。其中结构蛋白vp0不能进行豆蔻酰化；vp3的n端存在一段富含碱性氨基酸区域，大小约为20个氨基酸；vp1缺少rgd(arg-gly-asp)基序。非结构蛋白2a1的c端含有类口蹄疫病毒2a蛋白的保守基序dxexnpg↓p；2a2表现出与gtpase免疫相关蛋白家族十分相似的特征：2a3蛋白含有3个结构域，h-box、ncet和一个20aa组成的疏水区；2c蛋白含有保守基序epxxxxxxgxxgxgk(s/t)，qxxxxxddxxq和kgxxxxsxxxxxs/t；3c蛋白含有催化三联体h38-d69-c144；3d蛋白含有kdei、dxxxxxd、ygdd和flkr等高度保守的基序。基于多聚蛋白、vp1、2c、3d基因的遗传关系分析表明，dhv占据一个清晰的独立遗传谱系，应单独划属。本文对多个地区分离的29株dhv进行了分子流行病学研究，发现除04g、90d和ap03337、ap04009、ap04203毒株外，其余24个毒株的氨基酸同源性均在94.1％以上；vpi基因的变异最大，高变区主要集中在180-194位和213-219位；绝大多数毒株(24株)遗传距离较近，属同一分支；仅04g、90d株和ap04009、ap03337、ap04203株与其它毒株的遗传距离较远，占据不同的分支。结合代表毒株的血清交叉中和试验结果，表明当前国内流行的dhv毒株仍以血清1型为主。 本文对dhv的糖基化程度进行了细致分析，结果发现高度保守的潜在n-糖基化位点包括vp0蛋白的2个，位于47和78位；vp3蛋白的3个，位于32、35和201位；vp1蛋白的1个，位于84位；3c蛋白的2个，位于15和166位。 本文首次对人工盲传致弱的dhv scl03株进行了致病性和不同代次全基因组序列分析。发现鸡胚盲传至20代时，病毒对雏鸭的致死率明显降低，盲传至40代时完全丧失对雏鸭的致病性。但各代次毒株的基因组序列中未出现插入或缺失现象，仅存在大量的点突变，尤其是2c蛋白的18位n→k，3b蛋白的30位v→e，3d蛋白的9位v→a、48位q→k、157位k(碱性)→e(酸性)、159位n(亲水性)→i(疏水性)，259位v→a、296位h→l、424位s→t等变化具有一定的规律性，但其生物学意义尚待进一步研究。 本文根据序列分析结果自行设计2对引物，建立了针对1型dhv的rt-pcr检测方法，结果表明该方法具有较高的敏感性(rna模板最低检出量为100pg)和特异性，只能特异的检测出dhv，而不能检出鸭瘟病毒、小鹅瘟病毒、鹅副粘病毒、鸭h5亚型禽流感病毒、鸭h9亚型禽流感病毒等。该方法可用于自然感染dhv病料和人工感染发病雏鸭的各组织脏器中dhv检测。 本文首次进行了vp1基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达分析，选取以大肠杆菌表达的vp1重组蛋白作为检测抗原，建立了鸭肝炎抗体检测elisa方法。通过方阵试验确定抗原的最佳工作浓度为5.0μg/孔，血清最佳工作浓度为1:100；与中和试验比较发现，该方法具有较好的敏感性和特异性，与中和试验的符合率达97.5％；多份样品重复检测的变异系数较小，表明该方法具有较好的重复性；初步应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和疫苗免疫后抗体的消长测定。

关 键 词： 鸭肝炎病毒 生物学特性 鉴别诊断 基因组序列 检测

分 类 号： [S855.3 S858.32]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学]