导　　师： 王林川

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 番鸭“三周病”、小鹅瘟以及番鸭细小病毒型“白点病”是严重危害番鸭和鹅饲养业的传染病。三种疫病发病日龄相近，发病率和死亡率都较高，临床上常在同一地区流行，甚至混合感染，加之其流行病学、临床症状和剖检变化极为相似，其病原的dna序列同源性高，因此临床上鉴别诊断难度较大，常规诊断方法很难得到确诊，误诊现象严重影响着疫病防治措施的有效实施。因此，建立水禽三种细小病毒病的快速鉴别诊断技术是待业发展的瓶颈技术之一。 本研究首先从具有番鸭“三周病”、小鹅瘟以及番鸭细小病毒型“白点病”典型临床症状和剖检变化的病死番鸭和病死鹅组织中分别分离纯化到三种相应疑似病毒。 本研究根据genbank数据库中发表的番鸭“三周病”细小病毒(muscovy ducklying parvovirus简称mdpv)、小鹅瘟细小病毒(gpv)以及华南农业大学兽医传染病学教研室禽病组所分离到的番鸭细小病毒型“白点病”(muscovy duck white necrosis，mdwn)病原的ns基因的保守区设计了一对细小病毒的通用引物，扩增片段大小为426bp：根据genbank数据库中发表的番鸭“三周病”细小病毒、小鹅瘟细小病毒的vp1基因序列，同时结合华南农业大学所分离到的番鸭细小病毒型“白点病”病毒的vp1基因序列，利用dnastar primer5.0引物设计软件，在mdpv、gpv以及番鸭细小病毒型“白点病”病原的非同源区分别设计了mdpv和gpv特异性引物，预计扩增片段大小为590bp和290bp左右。 在建立pcr检测方法时，对pcr反应的退火温度、ex-taq dna聚合酶的浓度、引物浓度等进行了优化。通过优化结果，建立了番鸭“三周病”、小鹅瘟以及番鸭细小病毒型“白点病”的鉴别诊断方法。通过对该方法进行了敏感性、特异性、稳定性、重复性实验，结果表明，病毒核苷酸对细小病毒通用引物的敏感度分别达到了：mdpv：1ng、gpv：1ng、mdwnv：100pg;对特异病毒核苷酸检测的敏感度分别达到了：mdpv：1ng、gpv：100pg。该检测方法特异性强，敏感性高，稳定性和重复性都较好，能够对发病番鸭作出快速准确的鉴别诊断，为研制成分子生物学试剂盒奠定了良好的基础。运用该方法分别对人工发病和自然发病出现典型临床症状和剖检变化的病死番鸭和病死鹅组织进行了检测，结果均能检测到特异性病毒。通过对纯化病毒进行pcr扩增反应，结果均能出现目的条带。通过对pcr产物的回收，克隆测序等进一步的鉴定，其相似率达到80％以上，并证明所扩增片段是特异性核苷酸片段。因此，进一步证实了该方法具有很好的临床使用价值，对实际生产将具有非常重要的意义。

关 键 词： 细小病毒 病毒分离 病毒诊断 基因 克隆测序 纯化病毒 核苷酸检测 特异性病毒 水禽

分 类 号： [S852.659.2]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学]